桂花花色变异的机理和不同花色品种花瓣的cDNA-AFLP差异分析

【摘要】桂花（OsmanthusfragransLour.）隶属于木犀科木犀属（Osmanthus），是我国传统十大名花之一，在我国栽培有2500多年，集绿化、美化和香化于一身，是一种观赏和实用兼备的优质树种。桂花是一种芳香植物，桂花花香自古至今被我国劳动人民所利用，如制茶、食品、香料、入药等，桂花的花瓣精油中含有50多种芳香成分，很多成分在食品、香料等方面具有重要的应用价值。本文以桂花3个花色差异较大的品种：籽银桂（浅黄色）、金桂（黄色）和橙红丹桂（橙红色）为材料，对桂花花色变异的机理进行研究，并利用cDNA-AFLP技术筛选籽银桂和橙红丹桂盛花期花瓣中差异表达的基因，为桂花花色的调控研究奠定基础。主要研究结果如下：1.利用高效液相色谱技术（HPLC）分析了籽银桂、金桂和橙红丹桂3个品种5个不同花期花瓣中类胡萝卜素的含量，确定了3个品种中主要类胡萝卜素的组成成分。研究表明：籽银桂花瓣中，主要是积累了少量的β-胡萝卜素；金桂花瓣中主要积累叶黄素和β-胡萝卜素；橙红丹桂花瓣中积累了大量的α-胡萝卜素和β-胡萝卜素。3个桂花品种花色的差异主要是由类胡萝卜素种类和含量的差异引起的，初步阐明了桂花花色变异的化学机理。2.利用同源克隆的方法克隆了桂花类胡萝卜素代谢途径中相关基因的全长或者部分片段，并克隆了花青素合成途径中的4个关键酶基因（CHS、CHI、DFR和ANS）的部分片段。序列比对和与其它的一些种的聚类分析结果显示，克隆到的这些基因或者基因片段都与其它的一些种有较近的亲缘关系；这些基因的RT-PCR结果表明：3个品种花瓣中类胡萝卜素含量的差异是由代谢途径相关基因表达量的差异引起的，其中OfCCD4基因在籽银桂花期花瓣中的表达量较高，而该基因在橙红丹桂花瓣中表达量较低，这是籽银桂和橙红丹桂花瓣中类胡萝卜素含量差异的主要原因，也是这2个品种花色差异的根本原因。花青素合成途径中的DFR和ANS基因在桂花花瓣中几乎不表达，说明桂花花瓣中几乎不合成花青素。桂花花瓣的花色是由类胡萝卜素含量的多少决定的。3.桂花OfCCD4基因5’上游启动子区域和第一外显子CG岛的甲基化分析结果表明橙红丹桂启动子区域总甲基化比率显著高于籽银桂，第一外显子CG岛区域都不存在甲基化位点。说明在橙红丹桂花瓣中，OfCCD4基因表达量较低的原因是由于启动子区域甲基化比率较高，高甲基化比率影响了OfCCD4基因的表达。OfCCD4基因启动子区域的序列元件分析发现，在启动子上游含有2个W-box回文结构，说明该基因可能受WRKY转录因子的调控。4.从桂花花瓣中克隆了3个WRKY转录因子，表达分析显示，OfWRKY3与OfCCD4的表达模式基本一致，酵母单杂交结果表明，pB42AD-OfWRKY3和pLacZi-W-box重组质粒共转化酵母后，经Z-buffer/X-gal染色显蓝色，说明激活了β-半乳糖苷酶基因的表达。该结果表明OfWRKY3能与OfCCD4基因启动子区域的W-box元件相互作用，OfWRKY3参与OfCCD4基因表达的调控。5.利用cDNA-AFLP技术对籽银桂和橙红丹桂盛花期花瓣进行分析，共找到114个差异基因片段。这些基因包括物质代谢、能量代谢、抗逆、衰老、转录因子和未知基因等。由此可知，籽银桂和橙红丹桂花瓣基因表达的差异较大，涉及到多个代谢途径和信号转导途径。
【作者】韩远记；
【导师】尚富德；
【作者基本信息】河南大学，植物学，2014，博士
【关键词】桂花；类胡萝卜素；基因克隆；甲基化；cDNA扩增片段长度的多态性；

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