三硝基苯磺酸诱导肠易激综合征发生机制及酪酸梭菌对肠道通透性和免疫紊乱的调节作用

【摘要】背景肠易激综合征（IBS）是一种临床以腹痛、腹胀、排便习惯改变为特点的功能性胃肠道疾病，其病理生理机制仍不明确。全球范围内IBS总患病率为5%～25%，欧美等发达国家患病率为10%～15%，发病率为15%～20%。亚洲国家的IBS患病率在5%～10%之间，各地区报道IBS的患病率差异较大，而发病率为5%～10%，近年来呈上升趋势，尤其在我国差异尤为明显。研究显示，影响IBS发病的危险因素主要包括社会心理因素、遗传、感染、食物药物因素等。目前，IBS的病因和发病机制尚未明了，一个有效而稳定的动物模型是进行基础研究的重要因素。肠易激综合征(IBS)的发病机理尚不清楚。CD4+T细胞被认为参与IBS的致病过程。益生菌可以缓解IBS患者临床症状。越来越多的证据表明肠道微生物是IBS重要的致病机制之一。研究证实肠腔内的微生物定植、肠上皮屏障和肠道免疫系统相互影响。小肠和结肠紧密连接蛋白表达降低，导致肠道通透性增加已经被发现。目的利用三硝基苯磺酸(TNBS)结肠灌注成功诱导出内脏过敏、肠道黏膜通透性、肠道免疫功能紊乱的IBS小鼠模型。研究以CD4+T细胞为代表，以及CD4+T细胞分化异常等的肠道免疫系统紊乱在肠易激综合征（IBS）的病理生理机制重要作用。评价酪酸杆菌如何降低肠道内脏高敏状态、减轻肠道免疫系统紊乱和降低肠道通透性的干预的作用。方法①C57BL/6雄性6周龄小鼠共70只，随机分为3组。实验组（n=10）一次性TNBS结肠灌注，诱导IBS小鼠模型，每次200μl（2.5mg/只）。对照组（n=20）小鼠TNBS结肠灌注后等体积生理盐水灌肠。酪酸杆菌组（n=20），TNBS造模前2小时，酪酸杆菌灌胃每次500μL（活菌浓度1×109CFU/ml）每天1次，连续6天。同时，标准菌株组（n=20）使用标准菌株（E.coli）对照评价益生菌的作用。检测生理指标、结肠高敏状态、肠道病理损伤程度,评价IBS模型。分离肠道上皮内淋巴细胞(IELs)和固有层单核细胞（LPMC），流式分析，进一步评价IBS模型小鼠肠道免疫功能异常激活和紊乱状态及酪酸杆菌对肠道免疫系统紊乱的调节作用。②CD4-KO小鼠均一次性结肠灌注TNBS，同时分别进行生理盐水、益生菌（酪酸杆菌）等体积灌胃干预。C57BL/J6小鼠作为野生型对照。在24天,结直肠扩张(CRD)评估痛觉阈值改变情况。流式分析外周血T细胞水平变化情况，固有层巨噬细胞和记忆T细胞分布改变情况。过继转移CD4+T细胞值CD4-KOIBS小鼠，评价其免疫紊乱改变情况。③CD4+Tcells与结肠固有层来源的树突状细胞（DCs）共培养3天。检测CD4+T细胞亚型比例变化情况，上清液中细胞分泌炎症因子水平以及细胞内相应分子蛋白变化。④C57BL/6雄性6周龄小鼠共40只，随机分为4组。实验组（n=10）一次性TNBS结肠灌注，诱导IBS小鼠模型，每次200μ（l2.5mg/只）。对照组（n=10）小鼠TNBS结肠灌注后等体积生理盐水灌肠。酪酸杆菌组（n=10），TNBS造模前2小时，酪酸杆菌灌胃每次500μl（活菌浓度1×109CFU/ml）每天1次，连续6天；标准菌株组（E.coli）灌胃每次500μl（活菌浓度1×109CFU/ml）。24天后①检测肠道病理损伤程度和内脏敏感性改变；②检测肠道通透性和炎症水平；③检测肠上皮细胞（IEC）间紧密连接蛋白（TJ）（occludin-1、claudin-1、ZOL-1）蛋白水平变化。评价益生菌（酪酸杆菌）干预的影响。结果三硝基苯磺酸（TNBS）结肠灌注是一个有效的IBS动物模型.①实验组小鼠生理指标改变明显，实验组肠道出现低度炎症状态结肠膨胀试验（CRD）和最低阈值明显降低（t=8.926、6.103，P均＜0.001），提示C-IBS模型造模成功；②与对照组相比，实验组肠道IELs中树突状细胞（DCs）减少（t=2.878、3.086，P均＜0.05）而巨噬细胞增加（t=3.191，P＜0.05），记忆性T细胞无显著变化；③与对照组相比，固有层（LP层）树突状细胞（DCs）减少（t=2.880、2.664，P均＜0.05），记忆性T细胞增加（t=3.732、2.682，P均＜0.05）；④与对照组相比，酪酸杆菌组生理指标无变化；IELs中巨噬细胞、记忆性T细胞及DCs均接近正常水平(造模第6天，t=1.103、0.0243、0.418，P均＞0.05)，LP层中巨噬细胞和DCs(造模第6天，t=0.782、0.347，P均＞0.05)，与对照组相比均无显著性差异；⑤与实验组相比，酪酸杆菌组肠道LP层记忆性T细胞数量也显著下降（造模第6天，t=2.346，P=0.0470，P＜0.05）有显著性差异；仍高于对照组，有显著性差异（t=2.233，P=0.0476，P＜0.05）。酪酸杆菌干预后，肠道免疫系统功能恢复并接近正常水平。酪酸杆菌能够显著恢复肠道免疫系统紊乱的现象.野生型小鼠外周血CD4+、CD8+T细胞水平显著增高。CD4-KO小鼠外周血CD8+T细胞水平也显著增高。野生型小鼠固有层CD4+T细胞水平变化明显。CD4-KO小鼠结肠固有层（LP）巨噬细胞和记忆T细胞的比例显著提高。酪酸杆菌灌胃后，IBS痛觉阈值、LP层细胞比例和血清，均显著降低。过继转移CD4+T细胞能够显著降低CD4-KO小鼠结肠肠道低度炎症时的免疫反应强度。酪酸杆菌干预能有效调节CD4+T细胞亚型分化及细胞因子分泌紊乱对IBS致病机制中的作用.①IBS组来源的未分化CD4+T细胞显著增加。②CD4+T细胞与树突状细胞共培养后其亚型比例变化以Th1、Th17增加为主；酪酸杆菌干预后，以Th2、Treg增加为主，抑制Th1、Th17过度增加。③培养上清中细胞炎症因子Th1（TNF-α、IFN-γ、IL-1β）、Th2（IL-4、IL-13）、Th17（IL-6、IL-17）及Treg（IL-10、TGF-β）及细胞内蛋白变化与CD4+T细胞亚型变化基本一致。酪酸杆菌能够显著降低IBS小鼠肠道通透性异常增加.①与对照组相比，TNBS实验组肠道出现低度炎症和内脏敏感性增加、最低阈值明显降低(allP<0.05)。酪酸杆菌和E.coli灌胃干预后生理指标显著改善，空肠黏膜损伤明显减轻，浸润的炎症细胞数目显著减少，酪酸杆菌组优于标准菌株组（E.coli）(P<0.05)。②TNBS组小鼠血清D-乳酸(D-LA)、二胺氧化酶(DAO)和髓过氧化氢酶（MPO）水平显著增加（P<0.05）。酪酸杆菌和标准菌株（E.coli）干预后，血清中D-LA、DAO、MPO水平显著降低（P<0.05）。酪酸杆菌组MPO水平低于标准菌株组（E.coli）组（P<0.05）③TNBS组occludin-1、ZOL-1蛋白水平明显降低（P均<0.05）。酪酸杆菌和标准菌株（E.coli）干预后，occludin-1、ZOL-1水平明显增加（P均<0.05），酪酸杆菌组改善程度优于标准菌株组（E.coli）（P<0.05）。而claudin-1水平并未发生显著变化（P均＞0.05）。结论1.三硝基苯磺酸（TNBS）结肠灌注能够有效诱导肠易激综合征（IBS）小鼠模型，是一个稳定而有效动物模型。2.发现并证实肠道黏膜通透性增加与肠道CD4+T细胞活化及亚型分化，以及树突状细胞、巨噬细胞和记忆性T细胞等分布和激活异常等因素紧密相关。3.本研究首次证实酪酸杆菌能够有效抗炎、调节肠道免疫系统紊乱、显著低肠道黏膜通透性和内脏高敏状态的干预的作用，有效治疗IBS的各项症状，而恢复胃肠道功能。
【作者】陈东晖；
【导师】郑鹏远；
【作者基本信息】郑州大学，消化内科学，2014，博士
【关键词】肠易激综合征；三硝基苯磺酸；内脏高敏；低度炎症；免疫功能紊乱；通透性；酪酸杆菌；

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