异甘草素治疗脑胶质瘤的实验研究

【摘要】背景和目的：神经胶质瘤简称胶质瘤，占颅内肿瘤的40%~50%，是中枢神经系统最常见且最难治愈的恶性肿瘤之一，具有高发病率、高复发率、高死亡率的临床特点，预后极差。低度恶性胶质瘤（WHOI-II级）的平均存活时间是3~5年，高度恶性胶质瘤（WHOIII-IV级）的平均存活时间是1~2年，而总体手术后5年生存率不到10%。目前胶质瘤的主要治疗方案为手术以及放、化疗治疗，化疗常用药物主有亚硝脲类烷化剂、长春新碱、替莫唑胺等。化疗药物虽有一定疗效，但调查显示副作用较大，而且易产生耐药，在胶质瘤复发后的再次治疗中往往失去疗效，因此寻找更加高效、低毒的药物是目前临床胶质瘤治疗探索的一个方向。中药是我国医学璀璨的明珠，在千百年来国人的健康守护中发挥了重要的作用。中药甘草的根和茎可以入药，具有补脾益气、缓急止痛、祛痰止咳、清热解毒、调和诸药等功效，其成分之一异甘草素是一类异黄酮类化合物，为黄色针状结晶。研究表明异甘草素对一些肿瘤，如前列腺癌、宫颈癌具有一定的抗肿瘤疗效，同时具有一定的预防肿瘤复发、降低化疗药物肝肾毒性的药理作用。本研究探讨采用中药单体异甘草素抑制胶质瘤细胞的增殖以及侵袭转移，探讨其联合化疗药物顺铂抗胶质瘤的效果，为异甘草素在胶质瘤治疗方面的应用提供药理学依据。方法：1．异甘草素体外对胶质瘤细胞增殖、凋亡、侵袭的实验研究：采用MTT法、流式细胞术法、Transwell法检测不同浓度的异甘草素作用于胶质瘤细胞U87和C6的效果；同时采用Westernblot方法检测异甘草素作用后caspase-3、MMP-2、MMP-9、p21、p27、Akt、p-AKT等信号分子蛋白表达水平的变化；2．异甘草素联合顺铂抑制胶质瘤作用的实验研究：采用MTT法、流式细胞术检测异甘草素联合顺铂对胶质瘤细胞U87的增殖、周期以及凋亡的影响；采用westernblot方法检测caspase-3、bcl-2、bax等关键凋亡分子的变化；采用胶质瘤C6的异位移植瘤和原位移植模型来评价两者联合抗肿瘤的作用，并采用免疫组织化学分析方法检测瘤组织中的caspase-3和ki-67的表达。结果：1．MTT检测结果表明，不同浓度(0、5、10、20、40、80μmol/L)的异甘草素对U87和C6细胞的抑制率随药物浓度的增加而增加，异甘草素在24h、48h和72h对U87细胞的半数抑制率IC50分别为115.0、38.8和22.1μmol/L；异甘草素在24h、48h和72h对C6细胞的半数抑制率IC50分别为108.5、37.4和24.3μmol/L。流式细胞术分析表明，异甘草素在浓度大于60μmol/L可以导致细胞明显的S期和G2/M期阻滞，AnnexinV/PI双染凋亡分析表明异甘草素可以诱导胶质瘤细胞早、晚期细胞凋亡和坏死，而且在加入caspase广谱抑制剂Z-VAD-FMK后不影响异甘草素诱导的细胞坏死。Transwell结果分析表明：不同浓度的异甘草素（0μmol/L，20μmol/L，40μmol/L和60μmol/L）作用于胶质瘤U87细胞后对U87细胞侵袭力的抑制比率分别为0，17.2%，33.8%和57.3%。Westernblot分析结果表明：异甘草素以不同浓度（0μmol/L，20μmol/L，40μmol/L和60μmol/L）作用胶质瘤U87细胞后可下调MMP-2/9、p-Akt的表达水平，同时上调p21、p27以及caspase-3等蛋白的表达水平。2．MTT检测结果表明，异甘草素可以增强顺铂的抗胶质瘤效果，在顺铂浓度为6.25μmol/L和12.5μmol/L、异甘草素浓度为20μmol/L时二者有较好的联合指数。流式细胞术表明顺铂（6.25μmol/L）和异甘草素（20μmol/L）联合后可以明显增强胶质瘤细胞S期的周期阻滞，并导致细胞凋亡的明显增加，细胞早期凋亡比率从单独时的4.32±1.07%和2.25±0.44%增高到联合时的13.2±1.52%。Westernblot分析表明，异甘草素和顺铂联合可以上调caspase-3和bax的表达水平，同时下调bcl-2表达水平。体内实验表明：异甘草素可以增强顺铂的抗肿瘤疗效，异甘草素在500μg/kg条件下对胶质瘤的抑制率为31.0%，顺铂在1mg/kg条件下的抑制率为48.6%，两者联合后，对胶质瘤细胞的抑制率增加到66.9%。在胶质瘤原位移植模型中，异甘草素联合顺铂能够明显延长大鼠的生存期（与对照组相比，P<0.05）。免疫组织化学分析表明，异甘草素联合顺铂可以促进Caspase-3的表达（与对照组相比，P<0.01），同时下调ki-67抗原的表达（与对照组相比，P<0.01）。结论：1．异甘草素在10~80μmol/L浓度时对胶质瘤U87和C6细胞具有浓度相关性的生长抑制作用；能够诱导胶质瘤细胞G2/M期以及S期的阻滞和细胞凋亡、通过下调MMP-2/9、Akt磷酸化水平等因素来发挥增殖抑制作用；2．在不增加系统毒性的情况下，异甘草素可以增强顺铂的抗肿瘤作用，这可能与影响caspase-3、bcl-2、bax以及Ki-67等蛋白表达的水平有关。
【作者】周国胜；
【导师】宋来君；
【作者基本信息】郑州大学，神经外科，2014，博士
【关键词】胶质瘤细胞；异甘草素；顺铂；凋亡；细胞周期；

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