膀胱癌用BCG/Fe_3O_4/温敏凝胶集成材料靶向贴壁和缓释功能研究

【摘要】膀胱肿瘤(tumorofbladder)是泌尿系统中最常见的肿瘤,绝大多数来自上皮组织,其中90%以上为移行上皮肿瘤。在男性中位居第四位,女性中居第十位。肿瘤的扩散主要向膀胱壁内浸润,直至累及膀胱外组织及邻近器官。为防止肿瘤复发,术后可采用膀胱内药物灌注治疗。常用药物有丝裂霉素、阿霉素、羟基喜树碱及卡介苗(bacillusCalmette-Guerin即BCG)等,目前认为BCG效果最好。膀胱癌在灌注治疗过程中通常存在药物作用时间短,严重影响疗效,灌注次数多等问题。本研究拟利用冻干BCG设计一种新的灌注制剂治疗膀胱肿瘤—-BCG靶向缓释集成材料。该制剂将药物的靶向贴壁与缓释治疗引入到膀胱肿瘤治疗过程中,使BCG在膀胱内靶区停留时间超过48小时,可在一定程度上有效解决以上问题。Fe3O4属于尖晶石类铁氧体,其纳米粒子具备优良的超顺磁性。本文制备纳米Fe3O4采用了化学共沉淀法,并采用水浴、微波辐照、水热等方法对Fe3O4进行熟化处理,借助)CRD、TEM、VSM等方法进行测试分析。研究发现采用化学共沉淀法制备纳米Fe3O4时,Fe3+与Fe2+配比为1.75：1时最优,Fe3O4经熟化后其晶粒结晶度有所提高,颗粒尺寸在25nm以下,晶粒尺寸增大；比饱和磁化强度随熟化的温度或时间的延长而增大；纳米Fe3O4的比饱和磁化强度和结晶度经水热熟化处理后较高；纳米Fe3O4经200℃水热处理4h后,Ms可达80.0emu/g;微波辐照后的Fe3O4的Hc、Mr都较小,辐照20min后Fe3O4的Ms、Hc、Mr分别为74.6emu/g、14.5Oe、2.02emu/g。通过数据对比能够发现,化学共沉淀-微波辐照制备的Fe3O4超顺磁性较好。壳聚糖(CS)是甲壳素的脱乙酰基产物,由于其独特的生物活性、可生物降解性、生物相容性,在工业、农业、医药等领域得到广泛应用。壳聚糖-β-甘油磷酸钠(GP)温敏凝胶具有良好的组织相容性、无毒副作用、在生物体内可降解,使得CS/GP温敏水凝胶广泛应用到药剂学、组织工程等领域。壳聚糖-β-甘油磷酸钠温敏凝胶作为纳米磁性Fe3O4的载体材料,研究确定了其制备工艺参数。在壳聚糖温敏凝胶制备过程中加入纳米Fe3O4微粒,再经干燥粉碎得到Fe3O4/壳聚糖温敏凝胶磁性颗粒。SEM结果显示,由于凝胶粘度较大以及凝胶化过程中的疏水作用,Fe304产生比较严重的团聚,包覆凝胶后的Fe304颗粒粒径明显增大；XRD与IR结果显示,Fe304与凝胶基体并未发生反应；磁性能曲线表明制备的颗粒磁性能下降较大,Ms下降约80%,但颗粒仍然保持了一定的磁响应特性,且随着Fe304的含量的增加,复合颗粒的磁性能相应增大。采用分光光度计法和四唑鎓盐(XTT钠盐)法进行了BCG浓度的检测方法探究。冻干BCG为白色疏松体或粉末,复溶后为均匀悬液。其主要成份为卡介菌,辅料包括明胶、蔗糖、氯化钾、味精。XTT作为线粒体脱氢酶的作用底物,被活细胞还原成水溶性的橙黄色甲臢产物。当XTT与电子偶合剂(例如PMS)联合应用时,其所产生的水溶性的甲臢产物的吸光度与活细胞的数量成正比。实验结果表明,单纯的采用分光光度计进行BCG浓度检测,不同浓度的BCG溶液没有固定的吸收峰,无法准确的测定BCG的浓度；XTT钠盐由于其水溶性的显色反应能够反映细胞的活力,能够应用于细菌的活力检测。测定的吸光度值与配置的BCG溶液浓度呈现良好的线性比例关系,XTT方法将BCG浓度检测周期缩短为24小时,方法简单易行。在壳聚糖温敏凝胶制备过程中加入Fe304和BCG,充分搅拌分散均匀,获得载药靶向缓释复合凝胶,将凝胶高速机械粉碎得到BCG/Fe3O4/壳聚糖温敏凝胶磁性颗粒,并配制成灌注缓释液,探究BCG载药磁性复合颗粒的缓释性能。采用XTT法进行BCG缓释液浓度的检测,结果表明缓释液缓释初期在较短的时间内达到一个较高浓度,出现“突释”现象,约12小时后浓度变化逐渐趋于稳定,缓释至48小时仍能保持一定浓度,具有较好的缓释效果。由于其载药量不同,BCG药物包封率随着药物含量的增加呈现先增后降的趋势,药物含量10mg时包封率最高。基于扩散原理对缓释集成颗粒的一级方程缓释模型进行修饰,提出了靶向贴壁缓释集成颗粒的5参数对数缓释模型。对提出的5参数对数模型,以及常用的缓释模型从模拟精度、方差、预测精度等方面进行分析与比较。结果表明,构造的函数模型能准确地反映靶向载药颗粒的缓释性能。采用同样的方法制备BCG/Fe3O4/壳聚糖温敏凝胶靶向缓释颗粒,进行缓释集成颗粒靶向贴壁实验。首先在漏斗中进行体外贴壁实验,将载药靶向缓释颗粒悬浊液注入锥形漏斗,轻晃摇匀,用铷铁硼强磁体靠近漏斗侧壁,靶向磁性载药颗粒在外磁场的作用下能够聚集到漏斗侧壁上,实现可靠贴壁,漏斗内得澄清溶液；撤掉外磁场,再次轻晃漏斗,载药靶向缓释颗粒在液流作用下全部排出。其次,利用新西兰大白兔动物模型进行载药靶向缓释颗粒膀胱灌注,并通过X光及CT进行检查,可见复合材料在膀胱内部分散成堆聚集,BCG/Fe3O4/壳聚糖温敏凝胶复合颗粒贴壁效果良好。实验组按照每隔24小时处死,观察膀胱内BCG/Fe3O4/壳聚糖温敏凝胶复合颗粒情况。实验结果发现,膀胱贴壁24小时后仍有大量复合材料聚集,48小时后膀胱内材料随尿液排走较多,72小时膀胱内无材料残留。实验结果表明设计人体体外强磁体固定装置,利用强磁场作用,确保载药靶向缓释复合材料在人体膀胱内可靠贴壁,并维持48小时是切实可行和必须的。
【作者】吴承格；
【导师】孙康宁；赵冬梅；
【作者基本信息】山东大学，材料加工工程，2014，博士
【关键词】温敏凝胶；BCG；膀胱癌；缓释；靶向；

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