pH响应智能聚合物用于基因输送研究

pH响应智能聚合物用于基因输送研究

作者:师大云端图书馆 时间:2020-12-27 分类:硕士论文 喜欢:1758
师大云端图书馆

【摘要】尽管非病毒基因输送系统在肿瘤基因治疗领域具有广阔的应用前景,但由于人体和肿瘤微环境中存在多重屏障,使非病毒基因输送系统的效率、安全性及体内应用受到严重限制。鉴于肿瘤组织具有一些区别于正常组织的结构和代谢特点(如肿瘤的酸性环境、肿瘤细胞内高活性氧自由基等),可以通过设计对肿瘤组织某种环境特性敏感的基因载体结构,实现肿瘤靶向释放,从而提高治疗疗效和降低毒副反应。目前对环境响应性基因输送体系的设计中以pH响应的聚合物最受广泛关注和重视。本论文的主要研究工作是设计并合成了两种含有pH响应基团的聚合物,并对其作为智能基因输送载体的功能进行了研究,期望通过其在肿瘤组织中的结构和功能变化来克服基因输送过程中的主要屏障,实现高效基因输送。第一部分工作中,我们将丙烯酸二甲基氨基乙酯(DMAEA)通过迈克尔加成的方式嫁接到支链状PEI(bPEI,25kDa)骨架上,形成pH响应可降解聚合物PEI-DMAEA。PEI-DMAEA表现出pH敏感水解特性,在酸性条件下水解速率较慢,但在生理pH下聚合物很快发生水解,其表面电势很快从正电变为负电。这种特性使PEI-DMAEA与DNA形成的复合物被细胞内吞到内涵体之后,DNA能够得到有效地保护,而当复合物从内涵体逃逸到胞浆后,PEI-DMAEA快速水解并发生由正电向负电的电荷反转过程,随之将DNA彻底释放。实验表明,N/P在10以上时,PEI-DMAEA能够将DNA完全包裹并压缩,形成的纳米复合物粒径约150nm。但由于PEI-DMAEA在生理条件下水解速度过快,导致其与DNA形成复合物的基因转染效率偏低,最高仅7.40%。为调节PEI-DMAEA的水解速率,进一步利用碘甲烷将PEI-DMAEA中的部分三级胺季胺化。季胺化后,聚合物的水解速率明显降低,且季胺化程度越高水解速率越慢。选取40%、50%、60%季胺化的聚合物,在N/P为40时对DNA进行压缩包裹,并进一步在所形成的纳米颗粒表面包裹一层带有负电荷的乙氧基甲基丙烯酸(EOMA)和丙氧基甲基丙烯酸(POMA)的共聚物(pEP,EOMA与POMA的摩尔比为1:1),最终获得带负电的pEP/PEI-DMAEA/DNA纳米复合物。研究发现pEP/PEI-DMAEA/DNA纳米复合物的细胞摄取效率及基因转染效率均有了显著提高,最高转染效率可达未修饰PEI/DNA复合物转染效率的2倍。第二部分工作是在赖氨酸基础上,设计合成新型可降解非病毒基因载体聚赖氨酸苄酯。HPLC的表征显示,在pH7.4条件下,聚赖氨酸苄酯50h后的水解达到100%,然而在pH5.0条件下只水解40%左右,表明该新型聚合物具有pH敏感的水解特性。在体外培养的H1299人肺癌细胞系和HepG2肝癌细胞系中,聚赖氨酸苄酯的细胞毒性较PEI(25kDa)相比明显降低,提示其具有良好的生物相容性。同时,在N/P比率较低的情况下,聚合物已能很好地与DNA络合并形成稳定的、粒径约150zm的纳米复合物。DNA酶降解实验证实聚合物能够充分保护DNA免于被DNA酶降解。利用体外培养的H1299细胞及激光共聚焦显微镜、流式细胞分析等技术,我们观察了聚合物/DNA纳米复合物的亚细胞分布并检测了纳米复合物介导的基因转染效率。在处理细胞24h后,纳米复合物主要粘附在细胞膜上,小部分进入内涵体中,而处理36h后纳米复合物主要存在于内涵体中。基因转染实验表明,在氯喹存在的实验情况下,纳米复合物介导的基因转染效率高达40%左右,与PEI/DNA纳米复合物介导的转染效率相当,但其毒性较PEI明显降低。简言之,本论文设计和研究的两种新型pH响应智能聚合物值得做进一步深入研究和优化,并有望为基因治疗提供高效低毒的非病毒输送载体。
【作者】王凯;
【导师】隋梅花;申有青;
【作者基本信息】浙江大学,生物化工,2013,硕士
【关键词】非病毒载体;pH响应;电荷反转;基因输送;

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