新疆双峰驼乳抑癌活性蛋白组分的筛选及其作用机制

【摘要】新疆是中国双峰驼主要的分布区,占全国52%。驼乳具有抗疲劳、缓解肾衰竭的作用,并有一定的抗肿瘤活性和免疫增强作用,在新疆的少数民族传统医学中,很早就有以骆驼乳作为抑制肿瘤细胞生长的辅助治疗手段的记载,但其抗肿瘤活性成分与作用机理尚不明确。本研究以新疆双峰驼乳为研究对象,采用硫酸铵分级沉淀对驼乳清进行初步分离,MTT法筛选新疆双峰驼乳抑癌组分和敏感肿瘤细胞株；利用倒置光学显微镜、荧光显微镜、扫描电镜和透射电镜及观察肿瘤细胞形态的变化；流式细胞术检测驼乳清抑癌组分作用食管癌Eca-109细胞24h后,细胞周期、凋亡率和线粒体膜电位的变化；以及caspase-3、8、9凋亡蛋白的表达。结果表明,经分段盐析,当硫酸铵饱和度为35%-50%时所得驼乳清组分TR35对Eca-109细胞在内的11株恶性肿瘤细胞的增殖均有抑制作用,其中对人食管癌Eca-109、人宫颈癌Hela、人结肠癌HT-29、小鼠Lewis肺癌LLC、人前列腺癌22RV1细胞增殖的抑制效果最好,而对人胃癌BGC-823抑制效果较差。TR35组分可诱导Eca-109细胞的凋亡,且呈时间-剂量依赖性沪<0.01);在光镜和电镜下出现典型的凋亡特征,荧光显微观察到凋亡小体；Annexin-V/PI双染检测出现早期凋亡细胞；线粒体膜电位去极化,并将细胞周期阻滞在S期；caspase-3、9蛋白表达上调。结论：新疆双峰驼乳清蛋白组分TR35可抑制食管癌Eca-109等肿瘤细胞的增值,并通过上调caspase-3、9表达诱导食管癌Eca-109细胞凋亡,推测TR35组分诱导Eca-109细胞凋亡的途径可能与线粒体通路有关。为了探索驼乳有效组分TR35抑制Eca-109细胞增殖,诱导其凋亡的内部机理,采用RNA-Seq、2DE-MALDI-TOF/TOF-MS对处理24h的Eca-109细胞进行了差异转录组和蛋白质组分析。基于RNA-Seq数据,比较了Eca-109在TR35作用下基因的差异表达,以log2Ratio|(4mgA/conA)≥1和FDR(FalseDiscoveryRate)<0.001为筛选条件对检测结果进行筛选,得到上调的基因共259个,表达下调的基因共145个。GO功能富集分析和KEGG代谢途径分析表明：驼乳有效组分对Eca-109细胞的影响涉及多个生命过程,细胞过程和应激反应的调节,说明驼乳有效组分对Eca-109细胞的影响是多方面协同作用的结果。进一步对34个表达上调基因和31个表达下调的基因的功能进行了分析讨论。结果显示大部分和癌症发生发展相关的基因集中在凋亡相关的通路上,与前期实验结果相符。利用差异蛋白组分析,对双向电泳凝胶约2,000个蛋白点的比对分析,获取了33个差异蛋白点,其中32个得到成功鉴定。结合蛋白质组实验结果和RNA-Seq的数据,对共同变化的12个蛋白进行了功能分析。TR35的抑癌作用可能与氧化应激、能量代谢及生物合成相关,与线粒体功能相关。本研究对新疆双峰驼乳抑癌活性组分进行了筛选,在转录组和蛋白质水平上探讨了其诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制,为深入探索其内部机理提供了实验基础。
【作者】杨洁；
【导师】李冠；
【作者基本信息】新疆大学，动物学，2014，博士
【关键词】骆驼；乳清蛋白；食管癌Eca-109；抑癌活性蛋白；细胞凋亡；转录组学；蛋白质组学；

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