宿根矮化病菌侵染后甘蔗防御酶活性和蛋白质表达的变化

【摘要】甘蔗是热带和亚热带作物,又是典型的C4作物,其进行光合作用的能力远高于其它作物,也是我国最重要的糖料作物和最具有潜力的能源作物。甘蔗宿根矮化病(RSD)是一种由细菌引起的种苗传播病害,是甘蔗生产中最为严重的细菌病害之一,由于感染RSD的蔗株一般不表现典型的外部症状,极易造成病原菌的高度累积和大面积蔓延,造成甘蔗产量和糖分的损失,对宿根蔗的影响尤其严重。由于RSD病原菌体外很难分离培养,关于RSD病原菌致病性以及与甘蔗互作的研究受到一定程度的限制。本研究从感病的甘蔗体内分离、培养、纯化得到RSD病原菌,以此为抗原,制备RSD的多克隆抗体；并利用分离培养的RSD病原菌接种甘蔗,比较感染RSD病菌与健康甘蔗之间的防御酶活性变化,运用蛋白质组学方法比较其蛋白质的差异表达,寻找与RSD病菌胁迫相关的基因,利用同源克隆等技术对这些基因进行克隆和表达分析,结果表明：1、以PCR检测有阳性条带的甘蔗为材料,采用改良的SC培养基成功培养出RSD的病原菌Lxx,并分别从形态学、PCR检测、rDNA-ITS序列的比对多方面进行证实,确定此次培养的菌落即为RSD的致病菌Lxx,以此进行扩大培养,并与福氏完全佐剂混合乳化,皮下多点注射免疫兔子,制备RSD多克隆抗体。用间接ELISA法检测RSD多克隆抗体的效价,结果表明本研究所制备的RSD多克隆抗体的效价大于1：256000。用组织印记免疫(TBIA)的方法检测自制的RSD多克隆抗体并比较从美国引进的RSD多克隆抗体,结果两种不同来源的抗体检测蔗茎感染RSD的结果一致,说明RSD多克隆抗体已被成功制备。2、以接RSD病菌的甘蔗及健康甘蔗(GT11)为材料,研究RSD病原菌胁迫下甘蔗相关防御酶活性变化。结果表明在RSD病菌胁迫下,茎与叶中CAT、SOD、POD、APX及GR活性均有所提高,但不同防御酶在同一器官及相同的防御酶在不同器官表现均有所不同,在茎中除APX活性一直高于对照外,其它酶活性都表现为在90天时低于对照,180天时都高于对照；在叶中则与此相反,除POD活性一直高于对照外,其它则是在90天时高于对照,180天时都低于对照。这可能是由于RSD病原菌在茎与叶中侵入的时期不同,还有大量定殖时期不同而引起的。3、利用蛋白质双向电泳技术分析蔗茎在RSD病原菌胁迫下的蛋白质表达情况,发现40个差异蛋白点,其中有16个蛋白点表现上调,24个蛋白点表现下调,应用MALDI-TOF-TOF/MS串联质谱成功鉴定出23个蛋白质。根据功能将其分为6类,其中参与防卫反应的占31%、细胞生长和分裂占9%、蛋白修饰与加工占18%、基础代谢占23%、信号转导5%、未知功能的占14%,可见甘蔗对RSD病原菌胁迫的应答机制是一个涉及多系统、多水平的综合过程。4、采用同源克隆的方法克隆得到了4个与RSD病菌侵染相关的cDNA全长：甘蔗类异黄酮还原酶基因(SoIRL)、NADP-异柠檬酸脱氢酶基因(SoNADP-IDH)、乙醇脱氢酶基因(SoADH)及咖啡酸3-O-转移酶基因(SoCOMT):构建了这4个基因的原核表达载体,并成功导入大肠杆菌,获得了它们在大肠杆菌中的融合表达蛋白；荧光定量PCR分析发现这4个基因在甘蔗体内都为组成型表达,RSD病菌侵染及干旱(PEG)、低温(4℃)、激素(ABA)及高盐(NaCl)四种非生物胁迫下都能被诱导表达,但表达模式不尽相同。
【作者】谢晓娜；
【导师】杨丽涛；
【作者基本信息】广西大学，作物栽培学与耕作学，2014，博士
【关键词】甘蔗；宿根矮化病；防御酶；蛋白质组学；qRT-PCR；克隆；

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