禾谷镰孢菌TOR信号途径中关键基因的功能研究

【摘要】雷帕霉素作用靶标信号途径（TargetofRapamycin,TOR）在真核生物感受外界营养物质和胁迫、调控细胞生长中起重要作用。目前对于该途径的研究主要集中在模式生物酿酒酵母和哺乳动物中,但对丝状真菌中该途径的系统性研究尚未报道。阐明禾谷镰孢菌中TOR途径的生物学功能,对病害防控具有理论和现实意义。本研究综合运用分子生物学、生物化学等手段研究了禾谷镰孢菌TOR信号途径8个关键基因的生物学功能以及彼此的互作关系,结果发现：1.进行平板实验时,同等浓度的雷帕霉素（0.25μg/ml）比多菌灵、戊唑醇的抑菌效果更好,进一步通过显微观察发现,雷帕霉素处理后,菌丝膨大扭曲,隔膜变多,并且菌丝内积累了较多脂肪体。在添加不同浓度的雷帕霉素（0ng/ml.0.025ng/ml.2.5ng/ml.250ng/ml）绿豆液体培养基中摇瓶培养7d后,野生型的产孢量随着雷帕霉素浓度的增加而递减,但是雷帕霉素本身并不影响孢子的萌发。2.通过查阅相关文献,我们找出禾谷镰孢菌中的TOR信号通路的8个关键元件,并对这8个基因进行研究。这8个基因分别为FgFKBP12、FgTOR、FgTAP42.FgPP2A、FgSIT4、FgPPG1、FgTIP41、FgAREA.其中FgTOR、FgTAP42、FgPP2A基因经过多次转化,未获得敲除转化子,说明这些基因敲除后可能是致死的。另外的五个基因均能获得敲除转化子并且能够检测到表型变化,现将这五个突变体分别命名△FgFKBP12、△FgSIT4、△FgPPG1、△FgTIP41、△FgAREA。3.赤霉中共有三个FKBP同源基因,分别为FgFKBP12,FgFKBP20,FgFKBP54,FgFKBP12敲除后,突变体生长速率、致病性方面与野生型无显著差别,但是它对雷帕霉素以及FK506变抗。而敲除与FKBP12同源的另外两个基因则对雷帕霉素以及FK506不变抗。通过紫外诱变,获得一株对雷帕霉素变抗的突变体,将该突变体经过单孢分离后,通过测定突变体FgFKBP12以及FgTOR的DNA序列,发现该突变体FgTOR基因的第5597位的胞嘧啶变成了胸腺嘧啶（C5597T）,导致FgTOr的Fkbp12雷帕霉素结合结构域（Fkbp12一RapamycinBindingdomain,FRB）的第1866位的氨基酸从丝氨酸变成亮氨酸（S1866L）。为了进一步证实,该位点的点突变会导致雷帕霉素抗性,我们通过酵母双杂证实,在有雷帕霉素的情况下,FgFkbpl2能够与FgTor的FRB结构域互作,当FgFRB发生点突变时（FgFRBS1866L）时,无论有无雷帕霉素,FgFkp12都不能与FgFRBS1866L互作。4.虽然我们未能获得FgTAP42的敲除突变体,但是FgTAP42能够部分回补酵母中的温度敏感型突变体（tap42-11）在37℃条件下的生长缺陷,这说明Tap42同源蛋白在芽殖酵母和丝状真菌间的功能比较保守。FgTap42在芽殖酵母和禾谷镰孢菌中的亚细胞定位结果显示在酵母BY4741tap42-11中,FgTap42主要分布在细胞质中,而在禾谷镰孢菌中FgTap42均匀分布在菌丝的细胞质中,在分生孢子中,则定位于细胞核附近。酵母双杂结果表明FgTap42能够与FgPp2A,FgSit4和FgPpg1互作,但是它不与FgTip41互作。FgTap42与FgSit4和FgPp2A的互作分别被亲和捕捉和Co-IP再次证实。我们通过亲和捕捉还证实FgTap42能够与FgKog1互作,而FgKog1则是TOR复合体的重要组分。此外,我们通过酵母双杂和Co-IP证明FgPpgl能够与FgTip41互作。5.FgPP2A敲除致死而FgSIT4或FgPPG1敲除后,突变体生长严重减慢,而且在雷帕霉素处理后,菌丝内积累的脂肪体比野生型少;AFgSIT4和AFgPPG1致病力下降,分生孢子隔膜减少,也不能产生子囊壳；AFgSIT4和AFgPPG1对其它胁迫无明显变化,但是对刚果红、荧光白这两种细胞壁胁迫变得及其敏感。通过亲和捕捉以及酵母双杂交证实FgPpgl和FgSit4能够与FgMsg5（一个负调控细胞壁完整性信号途径的磷酸酶）互作,蛋白免疫印迹表明AFgSIT4和AFgPPG1的FgSlt2的磷酸化降低,而AFgMSG5中FgSlt2的磷酸化水平升高,因此FgSit4和FgPpgl是通过负调控FgMsg5而起到正调控细胞壁完整性信号途径（cellwallintegritysignalingpathway,CWI）,因此当FgSIT4或FgPPG1敲除后,突变体对细胞壁胁迫变得及其敏感；虽然AFgSIT4和AFgPPG1有很多相同表型变化,但是AFgSIT4产孢量和DON毒素量较野生型并无显著变化而AFgPPG1产孢量下降,DON量基本检测不到。6.FgTIP41敲除后（AFgTIP41）,突变体生长减慢,突变体产孢量正常,产子囊壳正常,但是致病力下降以及产DON量下降。FgAREA敲除后突变体（AFgAREA）在PDA上生长速率与野生型相差无几,但是菌丝变得稀疏,在MM培养基和以硝酸盐为唯一氮源的MM培养基上均不能生长,只有在添加铵盐或者谷氨酰胺后才能生长。△FgAREA能够产生子囊壳,在羧甲基纤维素液体培养基中能够正常产孢,但是致病性以及产DON量下降。表明FgTip41和FgAreA参与调控赤霉病菌的致病和毒素合成。7.上述结果表明赤霉病菌中TOR途径如下：雷帕霉素与FgFkbp12形成复合体,这个复合体能够结合到FgTor的FRB结构域并抑制FgTor行使正常功能。FgTap42作为TOR途径的下游的一个元件能够与FgKog1互作,同时FgTap42又通过与三个磷酸酶FgPp2A、FgSit4、FgPpg1互作发挥其生物学功能。FgSit4、FgPpg1通过负调控FgMsg5而起到正调控细胞壁完整性信号途径。FgPpg1还通过下游的转录因子FgAreA、FGSG09019和FGSG09709调节禾谷镰孢菌的毒素合成和致病力。该研究结果对发掘赤霉病菌TOR信号途径上的新药靶提供重要信息。
【作者】余方伟；
【导师】马忠华；
【作者基本信息】浙江大学，植物病理学，2014，博士
【关键词】雷帕霉素靶标信号途径；禾谷镰孢菌；小麦赤霉病；毒素合成；致病性；小麦；

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