新型植物乳杆菌细菌素PZJ5的分离纯化及特性研究

【摘要】防腐剂是食品工业中最重要的添加剂之一,使用防腐剂是防止食品变质的有效方法。目前我国大量使用的还是化学防腐剂,存在食品安全隐患。Nisin是世界公认安全的天然食品防腐剂；但Nisin抗菌谱较窄,只能抑制革兰氏阳性菌,对革兰氏阴性细菌、酵母菌、霉菌及病毒无抑制作用。植物乳杆菌素(Plantaricin)是由植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)产生的一种耐高、低温、耐酸、在人体中可降解、安全无毒,且具有较强抑菌活性的抗菌短肽。本实验室己分离到一株对典型革兰氏阳性和革兰氏阴性食品腐败菌均具有抑制作用的植物乳杆菌,本研究确定发挥抗菌作用的为肽类物质PZJ5,并进一步研究了PZJ5的分离纯化、理化特性、基因克隆及生物学信息、合成条件优化等因素。获得主要试验结果如下：(1)在酸性条件(pH≤5)下,细菌素PZJ5对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有明显的抑菌作用。PZJ5具有较好的热稳定性。该细菌素对胃蛋白酶非常敏感,胰蛋白酶、蛋白酶K均可使PZJ5抑菌活性降低。(2)发酵上清液经硫酸铵梯度沉淀、离子交换色谱、疏水层析和凝胶色谱纯化后,PZJ5得到了较好的分离,出现了单独活力峰,表明该细菌素样品已经达到了单一组分。经质谱测定PZJ5的分子量为2573.8Da,采用Edman法进行N端测序,获得了PZJ5的氨基酸序列：KTKQQFLIKAQTQLFKVFGYTLKK。(3)通过对细菌素作用后的指示菌恢复生长情况观察,发现细菌素PZJ5的作用模式为杀菌。通过透射电镜和扫描电镜观察,发现细菌素PZJ5通过导致细胞壁成孔或破裂,使指示菌细胞内容物泄漏,从而细胞代谢无法正常进行,最终导致细菌死亡。通过测定指示菌细胞内K+和核物质的泄露,发现乳酸菌素PZJ5可在极短的时间使指示菌菌体破裂,细菌内容物大量外泄,导致菌体死亡。(4)经基因克隆和测序分析,发现PZJ5的成熟肽氨基酸全序列为22个氨基酸残基：KTKQQFLIKAQTQLFKVFGYTL,在其N端还有一段信号肽序列：MSLVKENKTLVDELIAQITFGG。通过Blast比对,发现PZJ5是一种新的乳酸菌细菌素。经生物信息学分析,PZJ5成熟肽带有4个正电荷氨基酸,并且在第3位到第18位残基的位置上组成了一个两亲a-螺旋结构,符合膜作用原理。(5)通过对不同培养条件、培养基成分等因素的研究,采用PB试验和响应面法优化发酵条件。得到最佳产PZJ5条件为葡萄糖2.00%,酵母提取物为1.02%,接种量为2.06%。经过优化后,植物乳杆菌ZJ5所产细菌素的效价从未优化的474IU/ml增加到872IU/ml.
【作者】宋达峰；
【导师】朱睦元；顾青；
【作者基本信息】浙江大学，遗传学，2013，博士
【关键词】细菌素；PZJ5；植物乳杆菌；藤黄微球菌；博士学位论文；Nisin；天然食品防腐剂；成熟肽；食品腐败菌；基因克隆；

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