拟南芥细胞壁半纤维素结合铝的机制及其调控

【摘要】铝毒是酸性土壤上作物生长最主要的限制因子。铝胁迫可迅速抑制植物根系伸长,但其作用机制仍不十分明确。植物的耐铝机制包括外部排斥和内部耐受,虽然有机酸分泌是公认的铝外排机制,但越来越多的证据表明细胞壁在植物耐铝性上亦起着十分重要的作用,尽管这方面的研究仍处于起步阶段。本文在研究细胞壁半纤维素在拟南芥根系结合铝的贡献的基础上,通过半纤维素木葡聚糖含量、乙酰化修饰和支链结构相关的突变体xth(31,17,15),axy(4,3,8)和tbl7,深入系统地研究了其对半纤维素结合铝的影响；此外,通过yucca和mpk6等一系列的突变体,深入研究了激素和激酶对铝胁迫下的半纤维素的调控机制,得到以下主要研究结果：1.细胞壁半纤维素是铝结合的主要位点我们发现拟南芥铝处理后,半纤维素1含量显著增加。当用热水去除果胶后,铝处理过的根系细胞壁中的铝含量仅下降20%,而铝未处理过的根系细胞壁对铝的吸附量也仅下降20%,相反,当把半纤维素1去除后,铝处理过的根系细胞壁中的铝仅剩不到5%,铝未处理过的根系细胞壁对铝的吸附量也下降到30%左右,充分说明半纤维素在细胞壁对铝的吸附能力上起着决定性作用,其作用远大于果胶。鉴于木葡聚糖内源转糖基酶(xyloglucanendotransglucosylase,XET)在半纤维素合成及其调控中所起的重要作用,我们用激光共聚焦显微镜对XET酶活进行了实时半定量检测,发现铝胁迫下,XET活性显著下降的同时伴随着在根部表达的11个XTH基因中的XTH14,15和31这三个XTH基因表达的下调。上述研究结果表明,半纤维素是拟南芥细胞壁结合铝的主要组分,而XET活性的下降可能与铝诱导的根伸长受抑制有关。2.XTH31调控细胞壁半纤维素中的木葡聚糖含量以及拟南芥的铝敏感性我们以XTH31T-DNA插入的xth31突变体为材料,研究了其对铝胁迫的响应。XTH31全长有882个碱基,共编码294个氨基酸,生物信息学分析表明,XTH31借助于作为信号肽的N端的19个氨基酸锚定于细胞质膜上。虽然突变体在正常条件下的生长速度有一定减慢,但是其对铝的耐性显著增强,以35S:XTH31对突变进行回复后,其对铝的敏感性恢复到野生型水平,表明XTH31直接控制了拟南芥对铝的敏感性。正常生长条件下,突变体根系XET酶活的显著降低应该与突变体根系伸长减慢有一定的联系；在酵母中异源表达得到的XTH31蛋白富于XEH活性,同时也兼具了微弱的XET活性。体内铝含量分析表明,突变体无论是根系、细胞壁还是半纤维素,其A1积累量均显著降低,同时细胞壁对A1的吸附能力也有所降低；MALDI-TOFMS分析表明,突变体细胞壁中半纤维素的主要组分-木葡聚糖(xyloglucan,XyG)含量明显下降,而外源添加木葡聚糖在降低根系A1积累量的同时亦能显著提高植物对铝的耐性,表明木葡聚糖可能能与A1结合,而27Al-NMR检测进一步证明了木葡聚糖确实能与A1形成某种形式的复合物；最后我们用木葡聚糖缺失的双突变体xxt1xxt2验证了细胞壁木葡聚糖含量的缺失确实能大幅度降低根系细胞壁的A1积累量及其对A1的吸附能力。上述结果首次揭示了一个与半纤维素木葡聚糖含量有关的XTH31基因在植物抗铝性中的作用及其分子机制。3.XTH17与XTH31互作调控XET酶活,进而调节拟南芥对铝的敏感性拟南芥的XTH因家族共有33个成员,按其表达XET或XEH酶活的不同分为三类,XTH31属于groupⅢA的成员,异源表达的XTH31蛋白在体外有很高的XEH活性和极低的XET活性。为了解释XTH31在体外与体内酶活的差异,我们通过酵母双杂交的体外实验和蛋白质免疫共沉淀的体内实验,找到了能与XTH31互作的富于XET活性的XTH17蛋白,并进一步对xth17突变体进行了研究,发现xth17和xth31的表型基本相近,在正常条件下其体内的XET活性比较低,生长也相对较慢,而在响应铝胁迫时,又表现出了极大的耐性,同时无论是根系细胞壁铝含量的直接测定还是细胞壁对铝的吸附实验都表明xth17同xth31相似,其细胞壁的铝含量显著降低,并伴随着细胞壁半纤维素总糖含量的降低。因此,上述结果表明XTH17与XTH31以二聚体的形式调控XET酶活,进而调节拟南芥根系细胞壁对铝的积累量,最终影响拟南芥的耐铝性。4.木葡聚糖的O-7乙酰化修饰调控细胞壁半纤维素对铝的结合能力我们发现铝处理使拟南芥细胞壁,尤其是木葡聚糖的O-乙酰化程度显著降低,而两个木葡聚糖0-乙酰化程度降低的突变体axy4-1,axy4-3耐铝性显著下降,表明木葡聚糖O-乙酰化修饰程度的改变可以影响拟南芥对铝的抗性。进一步研究发现,与野生型WT相比,突变体根系和细胞壁均积累了大量的铝,同时突变体细胞壁果胶含量,果胶甲酯酶(PME)活性,果胶中的铝含量,半纤维素含量均与野生型差异不大。突变体与野生型唯一的差异就在于木葡聚糖O-乙酰化程度的降低,因此也间接地解释了铝胁迫下,拟南芥细胞壁木葡聚糖O-乙酰化程度的降低,就同铝处理下,其细胞壁果胶甲酯酶(PME)活性的增加一样,最终均会导致铝在植物细胞壁积累的增加以及植物铝敏感性的提高。5.木葡聚糖的岩藻糖化调控细胞壁半纤维素对铝的结合能力铝胁迫下,拟南芥细胞壁半纤维素中岩藻糖化和半乳糖化的木葡聚糖含量均增加。进一步研究发现,岩藻糖化的木葡聚糖含量降低的axy3.2和axy3.3突变体其耐铝性显著降低。体内铝含量分析表明,axy3.2和axy3.3突变体根系铝含量增加,细胞壁和半纤维素的A1含量却明显下降,同时axy3突变体细胞壁果胶含量,果胶中的铝含量,半纤维素含量与野生型差异不大,进一步表明axy3突变体细胞壁铝含量的变化是由于木葡聚糖结构的变化引起的,即细胞壁中岩藻糖化的木葡聚糖含量的降低直接导致了细胞壁对铝的积累量降低,更多的铝进入了突变体axy3.2和axy3.3细胞中；与此同时,存在于液泡膜上,可能参与A1向液泡转运的基因ALS1的表达在axy3突变体和野生型中却没有什么差异,表明axy3.2和axy3.3抗铝性的减弱与细胞壁中A1积累量的减少及进入细胞中的铝增加相关。为了进一步验证这一观点,我们在岩藻糖化的木葡聚糖含量增加的axy8-5和axy8-6突变体中观察到了相反的现象,即axy8突变体根系含A1量较野生型降低,但与野生型相比,其细胞壁和半纤维素的铝积累量均显著增加,从而减少了进入axy8细胞内的Al,使其表现出对Al的耐性,而以ALS1的表达量为代表的内部解毒机制也不参与axy8的耐铝性中。上述结果证明了岩藻糖化的木葡聚糖在较大程度上决定了细胞壁半纤维素对铝的结合能力。6.生长素调控细胞壁半纤维素结合铝的机制我们发现XTH15的插入突变体xth15铝的耐性显著增加,但内源生长素含量显著降低,而内源生长素含量增加的突变体yucca以及外源添加NAA的野生型对铝的敏感性均增加。进一步研究发现,无论是xth15,yucca还是外源添加NAA的野生型,其根系铝含量与野生型WT相比均没有显著差异,尽管与野生型WT相比,其根系细胞壁的铝积累量均降低。与此同时,存在于液泡膜上,可能参与A1向液泡转运的ALS1基因在xthl5突变体内的表达明显上调,而在yucca和外源添加NAA的野生型中其表达显著下调,此外,morin染色发现,存在于xth15细胞质中的Al含量显著低于野生型,而yucca和外源添加NAA的野生型其细胞质中的A1含量显著高于野生型,进一步验证了生长素能通过降低细胞壁铝含量和下调ALS1表达,致使更多的A1进入细胞内,且不易运入液泡解毒,从而增加A1对细胞质内器官的毒害作用,但ALSl启动子中不含生长素响应元件,其调控分子机制有待进一步研究。那么生长素是如何调控细胞壁对铝的结合能力的呢?我们发现A1处理提高内源生长素含量的同时,也显著增加了内源NO的含量,叠加NAA和A1处理时,NO的累积更加明显。外源施用NO加剧铝诱导的拟南芥根伸长抑制的同时,伴随着根系铝积累量的增加以及细胞壁,尤其是半纤维素铝积累量的降低。内NNO含量减少的突变体noal(NO合酶缺失)和nia1nia2(硝酸还原酶缺失)其耐铝性增加,根系铝含量降低,而细胞壁铝含量增加。细胞壁组分分析表明,外源添加NAA和GSNO均能显著降低细胞壁木葡聚糖的含量,并伴随着半纤维素铝积累量的降低；同时,在内源生长素含量增加的突变体yucca和生长素极性运输受抑制的突变体aux1-7中外源添加NO能进一步降低其细胞壁的铝积累量,而在内源NO含量降低的noal突变体中,外源添加生长素基本没什么效果,虽然外源生长素的添加能降低野生型和另一内源NO含量降低的nia1nia2突变体细胞壁的铝积累量,表明生长素确实通过NOA途径作用于NO上游来调控细胞壁对铝的结合能力。而存在于液泡膜上,可能参与A1向液泡转运的ALS1基因的表达在外源添加GSNO的WT或noa1以及nia1nia2中基本没什么差异,表明NO并不参与铝胁迫下的内部解毒机制。由此,我们认为生长素通过NO的作用降低细胞壁木葡聚糖的含量,进而减少铝在细胞壁的积累,致使更多的铝进入根细胞内,最终导致拟南芥铝敏感性的增加。7.MPK6调控细胞壁半纤维素结合铝的机制前面的研究中,我们发现铝处理能导致岩藻糖化和半乳糖化的木葡聚糖含量增加,但是这两种木葡聚糖寡糖含量的增加在mpk6突变体中缺失。为了进一步研究MPK6是如何影响细胞壁木葡聚糖对铝胁迫的响应,我们对一系列与木葡聚糖修饰及结构相关的细胞壁蛋白进行了生物信息学分析,发现只有TBL7具有MPK6发挥作用的底物特征(“SP”簇,其位点分别是第22,33,41和50位的丝氨酸)。酵母双杂交及体外磷酸化实验表明,MPK6能通过对TBL7进行体外磷酸化而产生互作。此外,mpk6和tb17突变体根系细胞壁及其半纤维素的铝含量均显著降低,表明MPK6通过TBL7来调控细胞壁半纤维素对铝的结合能力,这也是MPK6参与植物耐铝性调节的新发现。
【作者】朱晓芳；
【导师】郑绍建；
【作者基本信息】浙江大学，植物学，2014，博士
【关键词】铝毒；半纤维素；木葡聚糖；一氧化氮；生长素；拟南芥；岩藻糖化；半乳糖化；O-乙酰化；结构；修饰；XTH31；XTH17；XTH15；AXY3；AXY8；TBL27；MPK6；TBL7；

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