绒山羊肌内脂肪沉积特征及脂肪细胞分化机理的研究

【摘要】肌内脂肪含量是影响绒山羊肉品质的一个关键指标,直接关系到绒山羊的经济价值与肉用价值。内蒙古绒山羊胆固醇含量低、味美多汁,表现出优良的肉品质性状。因此,本研究以内蒙古白绒山羊为试验动物模型,探讨不同部位肌肉组织中肌内脂肪含量的沉积规律以及脂肪沉积代谢相关基因表达的变化特点,并在体外构建绒山羊肌内前体脂肪细胞,进行诱导分化,在细胞水平上对分化过程中成脂基因的表达模式进行研究。利用RNAi技术在转录水平上初步鉴定PPARγ基因调控绒山羊脂肪沉积的内在机制。在此研究基础上构建肌内前体脂肪细胞、成熟脂肪细胞、干扰组脂肪细胞和对照组脂肪细胞的RNA文库,应用IlluminaMiSeq测序技术对其进行高通量测序,利用生物信息学软件从测序评估、差异基因功能注释、可变剪接等方面进行分析,筛选调控脂肪沉积的关键基因。为肉用家畜肉质性状转基因育种提供更为广泛的基因来源。主要研究结果如下：1、脂肪沉积关键基因在不同肌肉组织中的表达情况与IMF相关性分析PPARγ基因的表达具有组织特异性,在膈肌、背最长肌、胸下矩肌和股四头肌中的表达量最高,极显著的高于半腱肌、股二头肌、腰大肌和腹外斜肌(P<0.01)。其次在肋间肌和斜方肌中的表达量也较高。FTO基因的表达水平要明显高于其他基因,在股四头肌和斜方肌中的表达量极显著高于其他部位,且两者之间有显著差异,背最长肌和腹外斜肌等部位中的表达量较低。相反,lipin基因在不同肌肉组织中的表达量较低,膈肌和胸下矩肌中的表达量较高,其次是在肋间肌、股四头肌和腰大肌,而腹外斜肌、背最长肌、半腱肌、斜方肌和股二头肌中的表达量极低。LPL和HSL是脂肪合成和分解的关键酶类,其表达趋势大致相同,仅仅在腰大肌和斜方肌这两个部位的表达模式相反。A-FABP和Perilipin基因表达模式也较为特殊,整体表达量较低,组织之间无显著差异,前者仅仅在胸下矩肌中有较高表达,后者是在股二头肌。总体上看绒山羊PPARγ基因mRNA与肌内脂肪呈负相关；而其他成脂基因HSL、LPL、FTO、lipin、perilipin、A-FABP基因mRNA与肌内脂肪含量呈正相关。2、绒山羊肌内前体脂肪细胞的构建及分化过程中脂肪沉积关键基因的表达情况采集1日龄绒山羊背最长肌,利用Ⅱ胶原酶消化法分离获得均一性良好,呈梭型的绒山羊肌内前体脂肪细胞。体外添加IBMX+DEX+INS,诱导细胞成脂分化,油红0染色可见胞内红色脂滴。RT-PCR检测脂肪沉积关键基因在前体脂肪细胞分化的早(D3)、中(D7)末(D11)三个时期,及诱导分化关键时间点(24h、48h、72h、96h)的表达,其中FTO基因在各个时间点显著高于其他基因的表达水平：LPL、lipin、perilipin、A-FABP和perilipin的表达模式相似,随着前体脂肪细胞培养日龄的增加和甘油三酯的积聚,其表达量逐渐升高；LPL基因在脂肪细胞分化的早期表达量最高,之后表达量有所降低,但一直维持高表达量的趋势；PPARγ随细胞诱导分化过程其表达量也逐渐升高,48h表达水平最高：A-FABP基因同PPARγ表达模式一致：lipin基因在各个时间点的表达丰度极低；HSL的表达量随分化程度的升高而逐渐降低；perilipin基因仅仅在诱导分化的后期有较高表达。3、沉默PPARγ基因对脂肪细胞增殖和分化的影响为了证明PPARγ基因在脂肪细胞分化过程中的重要作用。本研究首次构建山羊shRNA-PPARY慢病毒干扰载体,对肌内脂肪细胞的感染效率为80%,荧光定量和Westernblot检测慢病毒载体介导的shRNA可以有效的降低PPARγ的表达,发现其mRNA水平和蛋白水平的作用时间相隔24h。沉默PPARγ基因后脂肪细胞内甘油三酯浓度明显低于对照组脂肪细胞,表明其分化能力显著降低；通过MTT检测,干扰组细胞较对照组细胞增殖能力反而增强。其他脂肪细胞分化的相关基因LPL、FTO、A-FABP和perilipin基因的表达量随着PPARγ基因表达量的下调出现不同程度的降低,而HSL和lipin基因未检测到明显变化。由此可见PPARγ基因在脂肪细胞分化过程的调控中心位置,发挥着调控其他基因表达的关键作用。4、肌内脂肪细胞成熟前后、干扰前后比较转录组分析本研究基于RNA-seq高通量测序技术,得到16G表达谱数据,通过TopHat软件对肌内前体脂肪细胞、成熟脂肪细胞,shRNA-PPARγ脂肪细胞和对照组脂肪细胞4个样本两两比对筛选到表达量差异4倍以上的基因分别为152、450、456、412、39和445个,其中pref-1、FGF、TGF、TNF、RA、IL-21B和EGF等抑制脂肪沉积的基因在shRNA-PPARy干扰组肌内脂肪细胞中有较高表达。对这些差异基因进行G0分类和KGEE通路的初步分析,富集到与脂肪细胞分化有关的10条通路,差异最为显著的是PPARγ信号通路、Wnt信号通路、mTOR信号通路和MAPK信号通路。其中有六个基因LPL、FABP、FATP、AP2、RXRG和CD36富集到了PPARγ信号通路中,它们在成熟脂肪细胞中的表达量显著高于前体脂肪细胞,这与在细胞基础上的研究结果一致,表明这些基因可作为绒山羊肌内脂肪沉积新的候选基因。
【作者】杜琛；
【导师】李金泉；张文广；
【作者基本信息】内蒙古农业大学，动物遗传育种与繁殖，2014，博士
【关键词】绒山羊；肌内脂肪；基因；肌内前体脂肪细胞；RNAi；RNA-seq；

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