发酵灵芝多糖对肝癌细胞的抑制及其与血清蛋白的分子对接模拟

【摘要】灵芝为我国传统的名贵中药，具有抗肿瘤、提高机体免疫等功效。灵芝深层发酵技术缩短了灵芝的生产周期，增加了活性物的成分与含量，为灵芝的深度开发与利用奠定了基础。灵芝多糖为灵芝的主要活性成分之一，具有多种生物活性，特别是在抗肿瘤方面有较理想的药效。灵芝多糖在体内抗肿瘤活性的发挥也与人血清蛋白（HSA）对其存储和运输有关，因此研究灵芝多糖与HSA的相互作用对灵芝多糖的开发、剂量的调节以及药理的研究具有重要的参考意义。针对目前发酵灵芝多糖抗肝癌作用机制的研究较少，并且还未见多糖与HSA相互作用的研究，本论文以发酵灵芝多糖为研究对象，从直接抗肿瘤和免疫调节两方面探讨灵芝多糖对肝癌细胞HepG2的抑制作用；在此基础上采用miRNA芯片技术研究灵芝胞内多糖对HepG2细胞miRNA表达的影响；同时，由于典型致癌基因常为氧化受损DNA，而miRNA在芯片表面的连接方向为3’→5’端，在芯片杂交过程中氧化受损的DNA因空间位阻效应而影响核苷酸之间的配对。基于此，本文采用量子化学法结合Gussian软件研究了氧化受损DNA核苷酸与RNA核苷酸的相互作用。最后采用Discoverystudio2.5软件的ZDOCK模块研究多糖与HSA的分子对接，从多糖对HSA亲和力的角度来阐述多糖的抗肿瘤机制。本实验首先从灵芝深层发酵上清液中提取胞外多糖，从发酵菌丝体中提取胞内多糖。所获得的胞外多糖主要组分的重均分子量（Mw）为9074Da，其单糖组成（摩尔比）为岩藻糖：氨基葡萄糖：阿拉伯糖：氨基半乳糖：半乳糖：葡萄糖：木糖：甘露糖=1.00:0.19:6.16:0.11:12.03:83.08:10.05:3.42；胞内多糖主要组分的Mw为849475Da，其相应的单糖组成（摩尔比）为阿拉伯糖：半乳糖：葡萄糖：木糖：甘露糖=1.00:2.33:40.96:2.59:2.03。采用MTT法研究了灵芝胞内外多糖对肝癌细胞HepG2生长的影响。在浓度为500μg/mL，作用时间为48h时，胞外多糖与胞内多糖对HepG2细胞的抑制率分别为7.55%和29.52%。与此同时，考察了灵芝多糖对巨噬细胞Raw264.7NO释放量的影响，结果表明胞内多糖比胞外多糖更容易激活Raw264.7细胞从而释放出更多的NO。并且这两种多糖对Raw264.7细胞无毒性。在此基础上，采用miRNA芯片技术研究灵芝胞内多糖作用于HepG2细胞后对其miRNA的调控作用。结果发现共有61种miRNA产生差异性表达，包括其中17种miRNA的表达最为显著，miRNA-3131的表达上调了92倍。miRNA的调控同时反映在免疫相关和癌症直接相关的两个方面，揭示灵芝胞内多糖对HepG2细胞的抑制作用是通过这两个方面而不是通常所认为的仅仅通过免疫调控来实现的。DNA氧化受损是基因突变诱发癌症的主要原因之一。在芯片杂交过程中氧化受损的DNA核苷酸因空间效应而影响其与RNA（miRNA）核苷酸的配对。基于此本文运用量子化学法研究了4种氧化受损的DNA核苷酸（2OHA、8OHA、8OXOA、fapyA）与RNA或miRNA（A、C、G、U）核苷酸的相互作用。研究表明反式构型的8OXOA与G所形成的复合物最稳定。另外，顺式8OHA与C形成复合物后，其分子间发生了氢迁移，从而使复合物更加稳定。灵芝胞外多糖的抗肿瘤活性较弱，本实验室对其进行硫酸化修饰后发现其抗肝癌活性有所提高。其原因之一在于多糖的硫酸化修饰改变了多糖的构型。因此，多糖的生物活性与其构型密切相关。本文根据灵芝胞外多糖的单糖组成构建多糖模型。采用Discoverystudio2.5软件的Simulation模块构建了主链分别为α-葡聚糖（α-Glc）、α-甘露糖（α-Man）和α-半乳糖（α-Galc）的多糖。并且对每种多糖分别考虑1→3和1→6这两种糖苷键类型。在此基础上，构建取代度分别为1和2的硫酸化胞外多糖。从模拟的结果来看，α-(1→3)-D-葡聚糖有直链状构型的趋势，当硫酸基取代在C4和C6位上时该多糖构型也呈直链状，其余硫酸化的α-(1→3)-D-葡聚糖均呈无规线团；α-(1→6)-D-葡聚糖、(1→3)/(1→6)-α-D-半乳糖和(1→3)-α-D-甘露糖均以无规线团存在，它们的硫酸化衍生物大多为直链状构型；(1→6)-α-D-甘露糖的构象为直链型，且糖链带有一定柔性。硫酸基取代在C3位时该多糖呈无规线团。除此以外，该多糖的硫酸化衍生物均为直链状。这表明多糖经硫酸化后由于硫酸基团的静电排斥作用使得链的构型更为舒展。多糖与HSA的相互作用影响着多糖在体内抗肿瘤活性的发挥。本文采用分子对接法中ZDOCK程序研究上述各多糖模型与HSA的相互作用。结果表明，大多数硫酸化多糖对HSA的亲和力小于未硫酸化的多糖对HSA的亲和力。因此可以推测，硫酸化多糖在体内的游离浓度较高，利于药效的发挥。另外，本文根据灵芝胞外多糖的单糖组成采用半柔性对接CDOCKER研究二糖与HSA的相互作用。这些二糖在HSA不同的活性位点表现出不同的结合能力。在大多数情况下，在活性位点3和5处这些二糖与HSA的结合更稳定。
【作者】沈洁；
【导师】夏咏梅；
【作者基本信息】江南大学，应用化学，2014，博士
【关键词】多糖；抗肿瘤；免疫；miRNA；人血清蛋白；

【参考文献】
[1]陶新民,付丹丹,刘福荣,刘玉.基于多尺度并行免疫克隆优化聚类算法[J].控制与决策,2012,06:819-826.
[2]刘娟.生命的兴发与小学学困生的转化策略研究[D].湖南师范大学,教育（专业学位）,2013,硕士.
[3]曾庆鸿.情绪对冲突适应的影响[D].西南大学,发展与教育心理学,2014,硕士.
[4]房晓林.逆压电效应影响下功能梯度材料圆环板的力学行为分析[D].兰州理工大学,工程力学,2013,硕士.
[5]程胜.契约型基金中的基本法律问题研究[D].华东政法学院,经济法学,2003,硕士.
[6]蒋海亮.公司设立若干法律问题研究[D].湖南大学,经济法,2003,硕士.
[7]杜秀君.论那撒尼尔·霍桑《红字》中的象征[D].吉林大学,比较文学与世界文学,2004,硕士.
[8]关铭坤.针刺前四关为主治疗肝郁化火型失眠症的临床研究[D].广州中医药大学,中医学（专业学位）,2013,硕士.
[9]童丽丽.媒介新闻报道框架在时间维度中的变迁[D].南京大学,新闻与传播,2013,硕士.
[10]邢泽咏.结合活性自由基聚合和Suzuki偶联反应制备功能性聚合物[D].苏州大学,高分子化学与物理,2013,硕士.
[11]吴涵汐.明清版刻插图中女性形象的研究[D].浙江理工大学,美术学,2013,硕士.
[12]赵宏.公司购并风险的预警管理[D].武汉理工大学,交通运输工程,2003,硕士.
[13]余智胜,赵燕伟.皮革数控裁剪机伺服进给系统的设计与仿真[J].机电工程,2013,04:464-467.
[14]王明.基于Wowza Media Server网络监控系统研究与实现[D].宁波大学,电子与通信工程（专业学位）,2014,硕士.
[15]吴颉.我国管理层收购（MBO）透析[D].西南财经大学,工商管理,2003,硕士.
[16]吴亚军,董入芳,苏建军.农村剩余劳动力转移困难的成因与对策分析[J].农村经济.2004(02)
[17]宋玢.包头中心城区空间形态的演变与发展研究[D].西安建筑科技大学,城市规划与设计,2013,硕士.
[18]王伟.Importinβ蛋白负调节拟南芥microRNA活性机理研究[D].北京协和医学院,生物化学与分子生物学,2011,博士.
[19]李俊成,孙志挥,王维根.一种面向企业设备监测的关联挖掘算法及其实现[J].工业控制计算机,2004,12:1-3.
[20]石陆魁.非线性维数约减算法中若干关键问题的研究[D].天津大学,2005.
[21]张建华,苏玲,刘若溪,张旭,苏静.逆变型分布式电源微网并网小信号稳定性分析[J].电力系统自动化,2011,06:76-80+102.
[22]陈茶美.越南塑料企业营销管理问题研究[D].吉林大学,企业管理,2014,硕士.
[23]黄红梅.三维斑点追踪成像评价不同程度冠状动脉狭窄患者左心室整体及节段收缩功能[D].川北医学院,医学影像学与核医学,2014,硕士.
[24]丛浪屿.提升残疾人生活质量的社工介入模式探索[D].长春工业大学,社会工作,2013,硕士.
[25]陈丽.Android GUI自动化测试框架设计与实现[D].华中科技大学,控制工程,2013,硕士.
[26]高洁.建设银行业务系统性能测试通用模拟器的设计与实现[D].西安电子科技大学,计算机技术,2012,硕士.
[27]赵颖.童心烛照下的真与美[D].黑龙江大学,中国现当代文学,2013,硕士.
[28]高雅琪.一种手机访问MLDB的缓存替换策略应用研究[D].华中师范大学,计算机系统结构,2013,硕士.
[29]张善志,曹晨华,刘忠厚.关于微、喷灌施肥装置新技术的探讨[J].水利规划与设计.2005(03)
[30]张亚楠.时空视角下对企业经营的探究[D].北京交通大学,2014.
[31]郑善合.火力发电机组汽轮机高温部件变形及蠕变寿命的研究[D].华北电力大学（北京）,2008.
[32]付罗岭.硅胶固载TEMPO吸附NO_x催化体系对醇类的选择氧化研究[D].大连理工大学,应用化学,2013,硕士.
[33]张权.隔年深耕对土壤肥力及夏玉米生育和产量的影响[D].河南科技大学,作物栽培学与耕作学,2013,硕士.
[34]辛薇.新生代女性农民工就业问题研究[D].中国海洋大学,马克思主义中国化研究,2014,硕士.
[35]谭亮魁.数字地震仪磁带上记录号错录后的更正方法[J].石油地球物理勘探,1985,06:653+652.
[36]闫宇境.具有pH响应性和重金属吸附性的新型壳聚糖衍生物的合成和表征[D].吉林大学,材料学,2014,硕士.
[37]杨赫.国有商业银行战略性问题研究[D].对外经济贸易大学,2004.
[38]刘谞,杨钊,孙雪梅,刘小琪,张中,张青,李刚.建设广场[J].建筑创作.2005(07)
[39]杜彩君.农业科技园区建设及其在我国都市农业发展中的位置[D].中国农业大学,种植业,2004,硕士.
[40]刘亭丽.海鸥牌相机的发展历程与设计策略探索[D].华东师范大学,设计艺术学,2013,硕士.
[41]侯青.体验式广告设计研究[D].广西师范大学,美术学,2013,硕士.
[42]于妮.国际信托投资业的最新立法趋势及其对策研究[D].大连海事大学,国际法学,2004,硕士.
[43]严鸥鹏.大推力速燃单兵火箭发动机关键技术研究[D].国防科学技术大学,航天工程,2012,硕士.
[44]赵敏.民办幼儿园办园特色个案研究[D].内蒙古师范大学,教育（专业学位）,2013,硕士.
[45]黄丽,蒋练军,熊翠秀,张光富.张应力对石墨烯能量带隙的影响[J].中南大学学报(自然科学版),2013,05:1944-1947.
[46]张子伊.近代中国“卫生”概念之嬗变研究[D].北京外国语大学,比较文学与世界文学,2013,硕士.
[47]何方.电针对帕金森病模型大鼠泛素—蛋白酶体系统的影响[D].湖北中医药大学,针灸推拿学,2013,硕士.
[48]高广.包含磁力齿轮传动系统的数学模型与控制方法研究[D].上海交通大学,机械设计及理论,2014,硕士.
[49]程红柳.基于T-S模型的无线网络系统的量化保性能控制器设计[D].杭州电子科技大学,控制理论与控制工程,2014,硕士.
[50]陈强,努丽燕娜,郭维,杨军,王久林,郭玉国.可充镁电池正极材料PTMA/石墨烯(英文)[J].物理化学学报,2013,11:2295-2299.