真菌毒素类高灵敏高通量快速检测方法研究

【摘要】真菌毒素是一些真菌在生长过程中产生的致病性、致死性的次级代谢产物，在粮食生产、贮存、加工和流通环节都有可能因为保存条件不当污染真菌造成污染。由于大多数真菌素素的毒性剧烈，并具有致癌、致畸和致突变的“三致”作用，因此各种检测方法被开发用于检测粮食谷物中的各种真菌毒素。免疫分析法具有高灵敏、快速、高通量、多残留和现场检测的优势，现已发展成为真菌毒素检测快速筛查和检测的重要手段之一。本课题采用免疫学原理，将真菌毒素半抗原偶联到蛋白载体，通过免疫和细胞筛选，制备了特异性单克隆抗体的基础上，建立起黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素M1、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮、脱氧雪腐镰刀菌烯醇和T-2毒素六种物质的快速检测方法，主要研究内容如下：（1）将真菌毒素分子衍生后制备的半抗原，通过紫外、质谱等进行鉴定后，通过活性酯法或者CDI法与载体蛋白（血蓝蛋白、牛血清白蛋白和卵清蛋白）偶联，制备了六种真菌毒素半抗原的完全抗原；通过免疫BALB/c小鼠、细胞融合和亚克隆，总共获得8株针对六种真菌毒素特异性或群选型单克隆抗体。（2）对筛选得到的8株单克隆抗体的性质进行了鉴定，其亲和常数分别为黄曲霉毒素B14.2×109L/mol(11A9)和2.29×109L/mol(5C3)；黄曲霉毒素M11.28×109L/mol(G3D9)和2.29×109L/mol(H1)；赭曲霉毒素A1.09×109L/mol；玉米赤霉烯酮2.26×109L/mol；脱氧雪腐镰刀菌烯醇1.6×108L/mol；T-2毒素1.35×108L/mol。并测定了其抗体亚型和交叉反应率。（3）试验优化了包被抗原和一抗使用浓度、标准品稀释液的缓冲液的pH、离子强度、甲醇含量、一抗和二抗的反应时间、显色时间等ELISA条件。在最适ELISA条件下，测得抗体的IC50分别为：黄曲霉毒素B10.043±0.003ng/mL（11A9）和0.025±0.005ng/mL（5C3）；黄曲霉毒素M10.032±0.006ng/mL（G3D9）和0.035±0.005ng/mL（H1）；赭曲霉毒素A0.092±0.006ng/mL；玉米赤霉烯酮0.054±0.004ng/mL；脱氧雪腐镰刀菌烯醇31.60±2.89ng/mL；T-2毒素0.431±0.019ng/mL。（4）在建立的8株单克隆抗体细胞株基础上，建立了六种真菌毒素的ELISA，并通过添加回收对方法进行了验证，其回收率均在80%～120%之间，批内批间差异均小于20%。（5）通过优化酶解条件，制备了AFB1单抗的F(ab’)2片段，通过免疫兔子，制备得到AFB1的抗独特型抗体，并对其进行了鉴定。用来开发黄曲霉毒素无毒试剂盒；通过实际样品添加回收试验，其回收率在110%～130%之间，批内批间变异系数均小于10%。（6）制备了可用于快速现场检测的AFB1、AFM1、OTA、ZEN、DON和T-2生物毒素胶体金快速检测试纸条，其检测限LOD分别为0.2、0.1、0.2、1、50和5ng/mL，cut-off值分别为0.5、0.2、1.0、2.0、100和10ng/mL。（7）制备了可以同时检测4种真菌毒素（ZEN、T-2、AFB1和OTA）的试纸条，其LOD分别为2、16、1和2ng/mL，cut-off值分别为为4、32、2和4ng/mL。
【作者】张勋；
【导师】胥传来；
【作者基本信息】江南大学，食品营养与安全，2014，博士
【关键词】真菌毒素；单克隆抗体；ELISA；胶体金试纸条；

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