热凝胶制备β-1,3-葡聚寡糖及其诱导抗真菌功能的研究

【摘要】热凝胶是一种水不溶性、无分支微生物胞外β-1,3-葡聚糖，主要由土壤杆菌（Agrobacteriumsp.）在氮源限制条件下合成。除大量应用于食品、化妆品等领域外，热凝胶及其寡糖还因具有较强的生理活性而在生命科学领域逐渐受到重视。马铃薯作为一种重要的经济作物在世界范围内广泛种植，但是其生长过程中易受到微生物侵染而减产。以β-葡寡糖作为诱导子激活马铃薯自身的防御响应能够减少化学农药的使用量，是一种潜在可行的生物防治方法。基于此，本研究对热凝胶发酵生产、热凝胶寡糖制备以及热凝胶寡糖对马铃薯细胞防御响应诱导效果进行了考察，主要结果如下：(1)考察了产胶期溶氧水平（DO）对土壤杆菌ATCC31749产热凝胶发酵动力学参数、热凝胶流变性质及分子量分布的影响。测定结果显示，产胶期碳源转化率在DO5%-75%范围内基本稳定，但DO5%时生产强度（201mg·L-1·h-1）明显低于高溶氧水平。菌体比产物生成速率（qP）随着胞外热凝胶积累而逐渐下降（R2=0.939），通过提高溶氧水平qP保持稳定，上述相关性解除。测定发现，热凝胶碱溶液具有典型的假塑性流体特征（η=Kγn,n<1），随着发酵时间延长，该流变特征逐渐明显，且溶液表观粘度迅速增加。DO25%时，热凝胶溶液表观粘度高于其它溶氧水平。随后采用体积排阻层析方法测定了热凝胶分子量分布。结果显示，热凝胶平均分子量与溶液表观粘度具有相关性。产胶期溶氧水平DO25%有利于提高热凝胶平均分子量与溶液表观粘度。(2)建立了提高热凝胶颗粒在水解体系中稳定性的方法，并基于颗粒双层结构模型优化了硫酸水解热凝胶制备系列β-1,3-葡寡糖的策略。结果表明，热凝胶悬浮液经碱-中和方法处理后稳定性显著增加，处理后体系稳定时间超过20d，而相同条件下未处理样品静置5min后已完全沉降。随后验证了热凝胶颗粒的双层结构特点，即热凝胶颗粒由不溶性致密内核和水化胶体外壳组成。胶体外壳对热凝胶颗粒起到稳定作用且易于被水解，不溶性内核含量较高且温和条件下难于降解。然后，基于双层结构特点建立了两步硫酸水解制备热凝胶寡糖的策略，并采用HPLC方法纯化得到聚合度（DP）2-10的系列β-1,3-葡寡糖。采用该策略，低聚合度热凝胶寡糖（Mw<1000Da,DP2-6）和高聚合度寡糖（DP7-10）总含量比常规条件下分别提高了49.4%和58.8%。(3)建立了一种内切β-1,3-葡聚糖酶的纯化方法并对纯化后内切酶的蛋白和酶学性质进行了测定。结果表明，采用超滤-阴离子交换层析-体积排阻层析结合的方法在里氏木霉（Trichodermareesei）GIM3.498发酵液中纯化得到一种对热凝胶具有较高水解活性的内切β-1,3-葡聚糖酶（Endo23）。经测定，Endo23专一性水解β-1,3-葡萄糖苷键，最适反应温度和pH分别为50°C和pH5.0。Ag+,Al3+,Cu2+,Hg2+,Fe2+,Fe3+和Sn2+能够明显抑制Endo23的活性，K+在5和50mmol·L-1浓度时均可以提高该酶活性。初步将该酶分类为EC3.2.1.39。Endo23分子量为23.6kDa，等电点pI3.85，二级结构中α-螺旋含量为21.2%，β-折叠24.1%，β-转角19.1%，无规卷曲39.2%。氨基酸序列分析结果显示，Endo23部分氨基酸序列与糖苷水解酶16家族的催化区域保守特征序列一致。水解条件优化后发现，Endo23适用于制备聚合度DP2-4的低分子量热凝胶寡糖。(4)考察了热凝胶寡糖诱导马铃薯（SolanumtuberosumL.cv.McCainG1）叶片细胞产生防御响应的效果。测定结果显示，经热凝胶寡糖处理后马铃薯胞内H2O2迅速积累，水杨酸浓度在1h后达到峰值，同时苯丙氨酸氨解酶和病程相关蛋白（β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶）的比酶活在4-24h内均显著增加。结果表明热凝胶寡糖激活了马铃薯细胞的防御响应，然而响应水平随着诱导时间延长逐渐下降，20d后恢复至诱导前水平。进一步测定发现，热凝胶葡五糖是显著激活马铃薯防御响应的最小β-1,3-葡寡糖单元。随后，对经热凝胶寡糖诱导12h后表达量明显上调的10种蛋白进行了鉴定和功能分析。结果表明，热凝胶寡糖诱导使得马铃薯细胞产生了系统性的响应，包括对胞外诱导剂的识别、信号传递、代谢途径强化、胞内蛋白表达以及蛋白转运等一系列反应。(5)考察了微型马铃薯植株经热凝胶寡糖诱导后对致病疫霉（Phytophthorainfestans）的防御抗性效果。结果表明，采用P.infestans孢子悬浮液感染马铃薯叶片2周后，叶片损伤面积比例达到15.82%±5.44%，最终微型马铃薯株产量为6.82±2.80g。而在P.infestans感染前1d采用250mg·L-1热凝胶寡糖处理叶片，2周后叶片损伤比例下降至7.79%±3.03%，最终株产量10.37±3.58g，恢复至空白对照水平（10.01±3.75g）。而马铃薯植株经寡糖诱导处理5d后对P.infestans抗性并未达到显著水平。另一方面，P.infestans或寡糖处理对马铃薯粒重影响并不显著。分析表明热凝胶寡糖短期处理使得马铃薯植株对P.infestans的抗性增强。
【作者】李晶；
【导师】詹晓北；
【作者基本信息】江南大学，发酵工程，2014，博士
【关键词】热凝胶；β-1，3-葡寡糖；溶氧水平；双层结构模型；水解；内切；3-葡聚糖酶；马铃薯；防御响应；

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