高山被孢霉脂肪酸合成过程转录水平调控和还原力来源研究

【摘要】高山被孢霉（Mortierellaalpina）是一种具有良好的食品安全评估记录的工业产油真菌，脂质积累可以达到自身干重的50%。目前对高山被孢霉的研究主要集中在菌种选育和发酵条件优化等方面，但是对于其脂质积累的机理却没有一个全面系统的认识，从而为其脂质代谢相关基因的研究和遗传改造带来了困难。本研究通过对高山被孢霉转录组测序结果进行分析，揭示了高山被孢霉由增殖期转为脂质积累期的转录调控规律。在构建了高山被孢霉遗传操作系统后，分别通过同源过量表达和RNAi（RNAinterference）的方法进一步研究了苹果酸酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶产生的还原力（NADPH）在高山被孢霉脂质合成过程中的作用。主要研究结果如下：1.本研究对高山被孢霉由增殖期到脂质积累期不同样品的转录组测序结果进行了分析，发现高山被孢霉由增殖期转为脂质积累期的转录水平调控主要集中在如下两个方面：增加乙酰辅酶A和NADPH供给的同时减少除脂肪酸合成之外其他途径对乙酰辅酶A和NADPH的消耗；促进甘油三酯合成的同时抑制甘油三酯的分解代谢。推测高山被孢霉脂质合成所需的NADPH可能由磷酸戊糖途径和苹果酸酶共同提供。2.利用根癌农杆菌介导的转化方法，通过同源重组的方式敲除野生型高山被孢霉编码OPRTase的ura5基因，获得了遗传背景清晰的高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株。构建的质粒pBIG2-ura5s-ITs与尿嘧啶营养缺陷型菌株CCFM501组成的遗传操作系统，为高山被孢霉脂质积累机理的研究和基因工程改造提供有力的支持。3.在构建高山被孢霉遗传操作系统的基础上，通过对malE1基因的同源过量表达和RNAi，使脂肪酸含量分别升高了30%和降低了15%。揭示了ME1只是高山被孢霉脂质合成过程中所需NADPH的来源之一。通过同源过量表达malE2基因，在总脂肪酸含量没有受到影响的情况下，使高山被孢霉的花生四烯酸（Arachidonicacid，AA）产量增加了60%。由此可见，高山被孢霉的脂肪酸合成是一个受到NADPH影响的多因素调节的过程。4.为了更加全面的了解高山被孢霉脂质合成过程中所需NADPH的来源。我们以质粒pBIG2-ura5s-ITs为基础构建了RNAi载体，转化高山被孢霉并成功沉默了编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶的基因，沉默菌株脂肪酸含量分别降低了40%和15%。证明了高山被孢霉脂肪酸合成所需的NADPH主要由葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶和苹果酸酶共同提供，其中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶为细胞内提供了相对更多的NADPH。
【作者】郝光飞；
【导师】陈卫；
【作者基本信息】江南大学，食品科学，2014，博士
【关键词】高山被孢霉；脂肪酸合成；转录组分析；NADPH来源；

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