植物乳杆菌ST-Ⅲ盐应激反应及其协同保护作用的研究

植物乳杆菌ST-Ⅲ盐应激反应及其协同保护作用的研究

作者:师大云端图书馆 时间:2015-09-06 分类:毕业论文 喜欢:2722
师大云端图书馆

【摘要】在食品发酵与保藏过程中,乳酸菌常常生存在高盐环境中,高盐浓度引起的高渗透压可以触发细胞内水分外流,细胞胞质分离,从而引起细胞在结构和生理上的损伤,导致细胞停止生长,甚至死亡。因此,细胞能够适应盐胁迫,是乳酸菌在自然生境及工业生产中存活并生长的重要因素。为了维持细胞内的渗透压,细胞利用许多策略来适应对外界渗透压的变化,例如吸收钾离子、外排钠离子,以及从头合成或从外界吸收相容性溶质,但乳酸菌耐盐的分子机制尚不清楚。本研究以分离自泡菜的植物乳杆菌ST-III为研究对象,分别对其耐盐性能和利用相容性溶质的种类进行了研究,通过转录组学分析了植物乳杆菌ST-III的耐盐反应、甘氨酸甜菜碱在植物乳杆菌ST-III耐盐中的作用,对植物乳杆菌ST-III耐盐基因簇ProU进行了功能验证,还针对转录组结果中发现的现象进行了验证,即盐应激对胆盐胁迫及细胞粘附肠道上皮细胞的协同保护作用进行了研究,主要结果如下:(1)植物乳杆菌ST-III耐盐能力较高,能在盐浓度高达8%的化学成分确定培养基(CDM)中生长、繁殖。当在含盐的培养基中培养时,增加了植物乳杆菌ST-III的延滞期,且随着盐浓度的升高延滞期随之延长。不含盐的环境中,相容性溶质的添加并不影响植物乳杆菌ST-III的生长。甘氨酸甜菜碱、肉碱可以增加植物乳杆菌ST-III耐盐能力,但胆碱不能提高植物乳杆菌ST-III耐盐能力。植物乳杆菌ST-III通过转运甘氨酸甜菜碱、肉碱进入体内发挥作用,而非物理吸附。(2)利用RNA-seq技术研究植物乳杆菌ST-III在盐耐受时的整体反应,结果表明,盐的添加对植物乳杆菌ST-III的转录水平产生了影响,包括氨基酸转运及代谢、无机离子平衡、碳水化合物转运及代谢、细胞壁/膜/包膜的生物合成和DNA复制、重组、修复等。当植物乳杆菌ST-III在高盐(6%NaCl)浓度下培养时,与低盐(2%NaCl)浓度下培养时相比,更多编码无机离子转运体、相容性溶质转运体及DNA修复相关基因的表达量发生了变化。此外,在三个样品中(对照,2%NaCl,6%NaCl)共预测出146个ncRNA,其中有33个、54个和10个ncRNA分别只在对照组,2%NaCl和6%NaCl的样品中被预测到。在146个ncRNA中,成功预测到37个ncRNA的靶基因。(3)通过RNA-seq测序研究发现,当甘氨酸甜菜碱存在时,相容性溶质转运体的表达量并没有发生明显变化。甘氨酸甜菜碱的添加改变了编码碳水化合物转运和代谢,核糖体结构与合成,细胞壁/膜/胞膜生物合成以及无机离子转运和代谢等相关基因的表达水平。在三个样品中(1mmol/L甘氨酸甜菜碱,2%NaCl及1mmol/L甘氨酸甜菜碱,6%NaCl及1mmol/L甘氨酸甜菜碱)共预测出180个ncRNA,其中有82个、3个和1个ncRNA分别只在添加1mmol/L甘氨酸甜菜碱,2%NaCl及1mmol/L甘氨酸甜菜碱,6%NaCl及1mmol/L甘氨酸甜菜碱的样品中被预测到。在180个ncRNA中,成功的预测到28个ncRNA的靶基因。(4)通过系统发育分析发现,植物乳杆菌ST-Ⅲ的ProU基因簇与耐盐能力较高的戊糖乳杆菌IG1中相应基因的相似性达到100%。将ProU及其包含的基因proX、proW、proV分别克隆到质粒pNZ8148上,并电转化到耐盐能力较低的乳酸乳球菌NZ9000中,重组菌株在添加3%NaCl和1mmol/L甘氨酸甜菜碱的CDM培养基中培养,以原始菌株乳酸乳球菌NZ9000(pNZ8148)为对照,测定耐盐能力表明,各个基因均能在重组菌中表达,表达量与对照菌株相比至少提高了106倍,且重组菌株的耐盐能力均优于对照菌株,因此,ProU与植物乳杆菌ST-Ⅲ耐盐能力直接相关。(5)转录组结果发现,在含盐培养基中培养时,植物乳杆菌ST-III参与耐酸、耐胆盐及粘附相关基因的表达量发生了上调,因此本研究考察了盐应激对植物乳杆菌ST-III耐酸、耐胆盐及粘附肠道上皮细胞能力的影响。结果发现:植物乳杆菌ST-Ⅲ的耐酸性较好,在pH2.0的盐酸溶液中孵育60min后膜完整性几乎没有受到破坏。在含盐的培养基中培养增加了植物乳杆菌ST-III的胆盐耐受能力及粘附肠道上皮细胞HT-29的能力,且随着盐浓度的增加,植物乳杆菌ST-III的胆盐耐受能力及粘附肠道上皮细胞HT-29的能力也随之提高。本研究还考察了甘氨酸甜菜碱对植物乳杆菌ST-III耐胆盐能力及粘附肠道上皮细胞能力的影响。甘氨酸甜菜碱的添加并没有提高植物乳杆菌ST-III胆盐耐受及粘附肠道上皮细胞HT-29的能力。胞外多糖合成蛋白cps2A与植物乳杆菌ST-III粘附肠道上皮细胞的能力直接相关。
【作者】赵山山;
【导师】陈卫;
【作者基本信息】江南大学,食品科学,2014,博士
【关键词】植物乳杆菌;耐盐;甘氨酸甜菜碱;转录组;协同保护;

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