Cu和Cd对皱纹盘鲍幼鲍的毒性及饲料硒和硫辛酸对其解毒作用的研究

【摘要】本文以我国北方主要养殖贝类之一—皱纹盘鲍(HaliotisdiscushannaiIno)为研究对象，采用静水系统进行摄食生长试验。研究重金属Cu和Cd对皱纹盘鲍的毒性作用，并探讨饲料中的硒和硫辛酸对其解毒作用的影响，主要的研究内容和结果如下：1、为了研究不同浓度的水体铜对皱纹盘鲍存活率、抗氧化能力、脂质过氧化及组织Cu积累量的影响，采用0.02、0.04、0.06、0.08mg/LCu2+分别刺激皱纹盘鲍0、1、3、6、10、15、21、28天后，测定皱纹盘鲍肝胰脏抗氧化酶（超氧化物歧化酶SOD、过氧化氢酶CAT、谷胱甘肽过氧化物酶GPx、谷胱甘肽硫转移酶GST）、抗氧化小分子谷胱甘肽（GSH）、总抗氧化力（T-AOC）、丙二醛（MDA）的含量以及肝胰脏和肌肉组织中Cu积累量。结果发现，在0.04mg/L、0.06mg/L和0.08mg/LCu2+浓度下，皱纹盘鲍分别在实验的第21天、第10天和第6天全部死亡。在0.02mg/LCu2+浓度下，皱纹盘鲍在28天内存活率为100%。大体上来说，肝胰脏SOD和GST的活力随着时间的延长而呈下降的趋势，CAT和GPx的活力及GSH的含量在各Cu浓度下均高于对照组，肝胰脏T-AOC在各Cu离子浓度下呈下降的趋势。在0.02mg/LCu2+浓度下，MDA的含量显著升高后降低到对照水平。在0.04、0.06、0.08mg/LCu2+浓度下，MDA的含量均高于对照组。皱纹盘鲍肝胰脏和肌肉中Cu积累量随着浓度的增加和时间的延长呈上升的趋势。结果表明，在各Cu离子浓度下，Cu离子胁迫导致了皱纹盘鲍的氧化应激，CAT、GPx和抗氧化小分子GSH在抵抗Cu的氧化胁迫中发挥了重要的作用。而且Cu离子的胁迫导致了机体的脂质过氧化水平的提高，从而导致了皱纹盘鲍的死亡。2、本试验以初始重量为(3.17±0.01)g的皱纹盘鲍(HaliotisdiscushannaiIno)为研究对象，在其饲料中分别添加硒0.10、1.31和4.20mg/kg配制成3种半精制饲料，在Cu含量为0.02mg/L的静水养殖系统中饲养2个月，探讨饲料中的硒对皱纹盘鲍解毒中的作用。实验利用同源克隆技术和RACE技术从皱纹盘鲍的肝脏中成功扩增出金属硫蛋白(metallothionein,MT)和金属转录因子(Metaltranscriptionfactor-1,MTF-1)。MT基因全长cDNA序列包含个551bp，其中包括108bp的5’非编码区、255bp的3’非编码区和188bp的开放阅读框。其中开放阅读框编码69个氨基酸，预测分子量约为6.996KDa，理论等电点为5.16。MTF-1基因cDNA全长为2278bp，包括25bp的5’非编码区、626bp的3’非编码区和1566bp的开放阅读框，开放阅读框编码522个氨基酸，预测分子量约为59.63KDa，理论等电点为5.61。饲料中不同的硒添加水平对Cu胁迫下皱纹盘鲍生长和存活无显著性影响。1.31mg/kg硒实验组显著降低了皱纹盘鲍肝胰脏和血清中的Cu含量，且1.31mg/kg硒实验组鳃、外套膜、肌肉和贝壳中的Cu含量均低于对照组。饲料中的硒显著升高了肝胰脏TrxR的活力和GSH的含量。1.31mg/kg硒实验组肝胰脏MDA的含量和蛋白羰基含量均显著低于对照组。实验对皱纹盘鲍利用实时荧光定量PCR技术进行HdhMT及HdhMTF-1的表达分析。分析表明皱纹盘鲍肝胰脏中MT含量、HdhMT和HdhMTF-1mRNA表达水平呈现先升高后降低的趋势，即在1.31mg/kg的硒饲料组中的表达量最高，但是在4.20mg/kg的硒饲料组中表达量降低。上述的研究结果表明，硒的添加在一定程度上可以提高Cu胁迫下的皱纹盘鲍的抗氧化水平，降低脂质过氧化的水平和蛋白羰基水平。而且MT的mRNA的表达和蛋白含量及上游调控因子MTF-1受到饲料中硒含量的影响，说明MT可能在皱纹盘鲍抗Cu的毒性中发挥重要的作用。总体来说，1.31mg/kg的硒缓解Cu毒性的效果要好于4.20mg/kg。3、本试验以初始重量为(3.17±0.01)g的皱纹盘鲍(HaliotisdiscushannaiIno)为研究对象，在其饲料中分别添加α-硫辛酸0、0.7和2.1g/kg配制成3种半精制饲料，在Cu含量为0.02mg/L的静水养殖系统中饲养2个月，探讨饲料中的硫辛酸对皱纹盘鲍抗Cu毒性中的作用。在Cu离子的胁迫下，皱纹盘鲍的特定生长率(SGR)随着饲料中LA的增加而升高，但与对照组并无显著性的差异。0.7g/kg和2.1g/kg硫辛酸实验组皱纹盘鲍血清、外套膜、鳃、和肝胰脏中Cu含量显著低于对照组，2.1g/kg硫辛酸实验组的肌肉中Cu的含量显著低于对照组，但是0.7g/kg硫辛酸实验组肌肉Cu含量与对照组无显著差异。各LA处理组显著升高Cu胁迫下的皱纹盘鲍肝胰脏SOD、CAT、Se-GPx、GST的活力及GSH的含量。0.7g/kg组和2.1g/kgLA实验组的肝胰脏MDA的含量显著低于对照组。2.1g/kgLA实验组的蛋白羰基的含量和DNA断裂损伤显著低于对照组和0.7g/kg。0.7g/kg和2.1g/kg实验组的MT含量显著高于对照组。0.7g/kg实验组的MTmRNA表达显著高于对照组，并且0.7g/kg和2.1g/kgLA实验组的MTF-1mRNA的表达均显著高于对照组。上述的研究结果表明，硫辛酸的添加可以提高Cu胁迫下的皱纹盘鲍肝胰脏抗氧化水平，在一定程度上可以降低肝胰脏MDA的含量、蛋白羰基水平及DNA的断裂。而且MT的mRNA的表达和蛋白含量及MT被上游调控因子MTF-1调控的路径受到饲料中硫辛酸含量的影响，说明MT可能在皱纹盘鲍抗Cu的毒性中发挥重要的作用。4、为了研究不同浓度的水体Cd对皱纹盘鲍存活率、抗氧化能力、脂质过氧化及组织Cd积累量的影响，采用0.025、0.05、0.25、0.5mg/LCd2+分别刺激皱纹盘鲍0、1、3、6、10、15、21、28天后，测定皱纹盘鲍肝胰脏抗氧化酶（超氧化物歧化酶SOD、过氧化氢酶CAT、谷胱甘肽过氧化物酶GPx、谷胱甘肽硫转移酶GST）、抗氧化小分子谷胱甘肽（GSH）、总抗氧化力（T-AOC）、丙二醛（MDA）的含量以及肝胰脏和肌肉组织中Cu积累量。结果发现，在各浓度Cd浓度下，皱纹盘鲍在28天内存活率均为100%。皱纹盘鲍肝胰脏和肌肉中Cd积累量随着浓度的增加和时间的延长呈上升的趋势，且肝胰脏的Cd积累量大于肌肉。大体上来说，在各浓度Cd胁迫下，肝胰脏CAT、SOD和GST的活力随着时间的延长而呈下降到对照水平又升高的趋势，肝胰脏GSH的含量随着时间的延长先升高后降低，然后又变化的过程。然而，GPx的活力随着时间的延长呈下降的趋势。在0.05mg/L、0.25mg/L、0.5mg/LCd2+胁迫下，T-AOC的活力随着时间的延长先升高后降低到对照水平然后又升高的过程。SOD的活性第1天就发生了显著性的变化，GST、GSH和T-AOC在实验的第3天发生显著性的变化，CAT和GPx在实验的第6天发生了显著性变化。在各Cd浓度下，MDA的含量和对照组均无显著性差异。结果表明，在各Cd离子浓度下，Cd离子胁迫导致了的机体氧化应激，SOD、CAT、GST和抗氧化小分子GSH发挥重要的作用，且最敏感的的指标为SOD，其次为GST、GSH和T-AOC。Cd离子的胁迫并未影响肝胰脏的脂质过氧化水平，推测原因可能是皱纹盘鲍抗氧化系统的抵抗作用。5、本试验以初始重量为(3.17±0.01)g的皱纹盘鲍(HaliotisdiscushannaiIno)为研究对象，在其饲料中分别添加硒0.10、1.31和4.20mg/kg配制成3种半精制饲料，在Cd含量为0.35mg/L的静水养殖系统中饲养2个月，探讨饲料中的硒对皱纹盘鲍抗Cd毒性的作用。在Cd离子的胁迫下，饲料中不同的硒添加水平对Cd胁迫下皱纹盘鲍生长和存活率无显著性影响，并且4.20mg/kg硒饲料组的SGR最大。在血清、肝胰脏、外套膜和鳃中，1.31mg/kg和4.20mg/kg硒处理组的Cd含量显著低于对照组。在肌肉组织中，4.20mg/kg处理组的Cd含量显著低于1.31mg/kg硒的处理组及对照组。饲料中硒的添加可以显著升高Cd胁迫下的皱纹盘鲍肝胰脏Se-GPx、TrxR、TPx的活力及GSH的含量。1.31mg/kg组和4.20mg/kg硒饲料组的肝胰脏MDA的含量和蛋白羰基含量、DNA的断裂均显著低于对照组。1.31mg/kg和4.20mg/kg的饲料组皱纹盘鲍肝胰脏MT的含量均显著高于对照组。上述的研究结果表明，饲料中硒的添加可以提高Cd胁迫下的皱纹盘鲍肝胰脏抗氧化水平，降低Cd胁迫下的肝胰脏MDA的含量、蛋白羰基水平及DNA的断裂。而且肝胰脏MT的含量受到饲料中硒含量的影响，说明MT可能在皱纹盘鲍抗Cd的毒性中发挥重要的作用。6、本试验以初始重量为(3.17±0.01)g的皱纹盘鲍(HaliotisdiscushannaiIno)为研究对象，在其饲料中分别添加α-硫辛酸0、0.7和2.1g/kg配制成3种半精制饲料，在Cd含量为0.35mg/L的静水养殖系统中饲养2个月，探讨饲料中的硫辛酸对皱纹盘鲍抗Cd毒性中的作用。饲料中不同的LA添加水平对Cd胁迫下皱纹盘鲍生长和存活均无显著性影响。0.7g/kg和2.1g/kg硫辛酸实验组皱纹盘鲍血清、外套膜、鳃、和肝胰脏中Cd含量显著低于对照组，2.1g/kg硫辛酸实验组的肌肉中Cu的含量显著低于对照组，但是0.7g/kg硫辛酸实验组肌肉Cu含量与对照组无显著差异。LA的添加可以显著升高Cd胁迫下的皱纹盘鲍肝胰脏CAT、Se-GPx、GST的活力及GSH的含量。0.7g/kg和2.1g/kgLA实验组的肝胰脏蛋白羰基的含量和DNA的断裂显著低于对照组，2.1g/kgLA实验组的肝胰脏MDA的含量显著低于对照组和0.7g/kg实验组。0.7g/kg和2.1g/kg实验组的MT含量、MTmRNA和MTF-1mRNA的表达均显著高于对照组。上述的研究结果表明，硫辛酸的添加可以提高Cd胁迫下的皱纹盘鲍肝胰脏抗氧化水平，在一定程度上可以降低肝胰脏MDA的含量、蛋白羰基水平及DNA的断裂。而且MT的mRNA的表达和蛋白含量及上游调控因子MTF-1受到饲料中硫辛酸含量的影响，说明MT和MT被上游调控因子MTF-1调控的路径可能在皱纹盘鲍抗Cd的毒性中和降低组织Cd含量中发挥重要的作用。
【作者】类延菊；
【导师】麦康森；
【作者基本信息】中国海洋大学，水产养殖，2014，博士
【关键词】皱纹盘鲍；Cu；Cd；硫辛酸；硒；金属硫蛋白；抗氧化；氧化；

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