朱鹮Ⅰ、Ⅱ类MHC多位点单倍型及其适应性进化研究

【摘要】朱鹮(Nipponianippon)作为世界濒危物种及国家一级重点保护动物,曾广泛分布于东亚地区。但其种群在19至20世纪因人类及自然破坏而迅速衰退,甚至濒临灭绝。而1981年在中国陕西省洋县重新发现的7只野生朱鹮则成为目前所有已知个体的奠基者。如今种群数量已突破2000只,主要分布于1个野生种群及6个人工种群。但由于曾经历严重的瓶颈效应及近亲交配,其种群在变幻莫测的环境压力下仍危机重重,发展前景依旧未卜。MHC是脊椎动物免疫系统中高度多态的一种多基因家族,其编码的蛋白受体能识别并传递抗原,从而启动免疫应答,由此成为了一种热门的适应性分子标记。但目前MHC的种群研究多集中于等位基因水平,且相关的朱鹮研究匮乏。鉴此,本文以7个朱鹮种群共307只个体为研究对象,基于实验室已构建的BAC文库物理图谱,完整建立了一套MHCⅠ、Ⅱ类基因的标记系统,并在多位点连锁单倍型水平辅以微卫星中性标记,对MHC进化机制、遗传变异、种群分化、适应性潜力、保护策略等多个方面进行探讨。主要研究结果如下：(1)对BAC中5个Iα座位的exons2、3分型结果显示,Nini-VCA、-UEA为单态,Nini-UAA、-UBA、-UDA为二态,且UBA、UDA的等位基因均仅单个沉默的碱基差异。组织表达检测显示,UAA强表达于所有组织,UEA弱表达于所有组织,而UBA、UCA、UDA则在组织间具有表达强弱的差异。cDNA全长序列表明,UEA提前终止于exon5。综合以上结果及序列分析判断UAA为主要经典座位,UBA、UCA、UDA为次要经典座位,UEA为非经典座位。(2)结合重组及系统发育分析推测UBA和UCA(或UDA)可能分别为早期的主要和次要基因,通过复制与重组产生了UAA和UEA。而基因组全长序列几乎一致的UCA和UDA,则揭示了朱鹮内的一次近期座位复制事件。(3)对BAC中4个Ⅱα(DAA)和4个Ⅱβ(DAB)座位的exon2分型结果显示,除Nini-DAB1具4条等位基因外其余座位均单态,而Nini-DAA2、-DAA3、-DAA4和Nini-DAB2、-DAB3、-DAB4在个体间具有分布差异,造成Ⅱ类区的结构多态,所有等位基因均表达。基于所有Ⅱ类座位和Ⅰ类主要座位UAA的等位基因组合分布,共识别出7种单倍型,同时针对具有结构差异的Ⅱ类区获取了其在各单倍型中的完整基因组序列。(4)7种单倍型又分为四组,即HT01(BAC单倍型),HT02、06,HT03、07,HT04、05,每组内Ⅱ类区相同但UAA等位基因不同,而四组分别具有4、3、2、1个串联重复的“αβ”单元(包含一对DAA、DAB座位)。在所有单倍型中,DAA2、DAA3、DAA4的序列几乎一致,为复制关系,且明显区别于DAA1；而DAB较为复杂,多条序列具有重组造成的镶嵌式结构,但所有具差异的基因区域亦呈二态(exon2虽多态但也聚为两簇)。(5)基于重组和系统发育分析模拟了朱鹮MHC单倍型的进化过程：HT03、07为朱鹮的原始单倍型,其上的两个“αβ”单元即对应鸟类中提出的在早期复制产生的两对Ⅱ类谱系基因,故该种单倍型甚至可能代表鸟类原始的ⅡⅡ类区结构。通过在朱鹮两个原始Ⅱβ座位间发生的两轮伴随同源重组的不等交换,相继产生了具有结构差异及镶嵌式DAB序列的多种单倍型,并通过Ⅱ类区与Ⅰ类UAA间的重组进一步多样化。(6)Ⅰ、Ⅱ类中复制产生的基因可分为两种截然不同的进化命运：一些基因拷贝保持原有序列,形成可能具备缓冲效应、产量优势的基因冗余；而另一些则在正向选择作用下快速变异为新的功能序列。另外,Ⅰ、11类中共同存在的基因复制、基因转换及重组事件也揭示,朱鹮MHC可能经历了共同的进化模式,即作用于不同时期的生死模型和协同进化。(7)基于朱鹮多位点MHC单倍型辅以微卫星标记的种群分析表明：两者均显示了低水平的遗传多样性,且等位基因丰富度显著相关,结合显著的历史正向选择,推测朱鹮种群曾具有高水平的MHC多态性,但这种选择作用却无法与遗传漂变相抗衡,故在瓶颈效应后两种多样性均骤减。7个朱鹮种群在MHC和微卫星上已出现相同的遗传分化,即group1(DQ、YX、LGT、Wild)、group2(HN、SD)、group3(BJ)。其中,group1的基因资源最为丰富,而groups2、3则呈现单一化。通过比较MHC和微卫星所揭示的种群分化度,证明7个种群中的选择压力均较弱且无显著差异,而人为导致的奠基者效应才应是种群分化的主导因素。(8)建议将MHC单倍型作为今后朱鹮保护管理中的一项重要评估指标,结合单倍型差异及当前种群结构合理开展人工繁殖、个体交换、种群建立及再引入。并在下一步的研究中探究不同结构的MHC单倍型与免疫疾病的相关性。
【作者】蓝泓；
【导师】方盛国；万秋红；
【作者基本信息】浙江大学，生态学，2014，博士
【关键词】朱鹮；MHC；单倍型；基因复制；重组；

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