BMP9和13对C3H10T1/2细胞心肌样分化及改善心梗后大鼠心功能的影响

【摘要】第一部分重组腺病毒BMP9，BMP13的扩增及分别转染C3H10T1/2细胞目的：利用重组腺病毒BMP9，BMP13和GFP的病毒原液分别转染HEK293细胞从而反复扩增获得高滴度的重组腺病毒BMP9，BMP13和GFP，利用AdEasy-BMP9，AdEasy-BMP13,AdEasy-BMPGFP转染C3H10T1/2细胞使其分别过表达BMP9和BMP13基因。并以新生C3H小鼠的原代心肌细胞作为实验阳性对照，未处理的C3H10T1/2细胞作为空白组。方法：利用HEK293细胞反复扩增获得高滴度的重组腺病毒BMP9，BMP13和GFP。以C3H新生小鼠（1-3d）原代培养心肌细胞作为实验阳性对照。复苏后传代培养的C3H10T1/2细胞于倒置显微镜下观察，当观察到视野中的细胞生长融合达70%左右时，将AdEasy-BMP9，AdEasy-BMP13,AdEasy-GFP加入培养基中转染C3H10T1/2细胞，利用荧光显微镜下估算和流式细胞技术直接检测两种方法明确各腺病毒转染组细胞的转染效率，并利用实时荧光定量PCR测定各组细胞中BMP9，BMP13的表达情况。结果：1.经过HEK293细胞反复扩增，获得了后续试验用于转染C3H10T1/2细胞的高滴度重组腺病毒BMP9，BMP13和GFP。2.利用C3H新生小鼠（1-3d）心肌细胞分离纯化进行原代培养，光镜下可见细胞呈梭形或多边形，并有自主搏动。作为实验阳性对照。3.利用荧光显微镜下估算和流式细胞技术直接检测两种方法明确三种腺病毒分别转染C3H10T1/2细胞后的转染效率，实时荧光定量PCR测定BMP9组细胞（重组腺病毒BMP9转染后的C3H10T1/2细胞）的BMP9表达量为GFP组和空白组的120-125倍，BMP13组细胞（重组腺病毒BMP13转染后的C3H10T1/2细胞）的BMP13表达量为GFP组和空白对照组的125-130倍。(p<0.05)结论：利用HEK293反复扩增得到的高滴度重组腺病毒BMP9，BMP13和GFP，分别转染C3H10T1/2细胞后能够使其获得较高的转染效率，并分别高表达BMP9、BMP13以及GFP。第二部分BMP9及BMP13在体外对C3H10T1/2细胞心肌样分化的影响及其差异目的：研究并比较BMP9（骨形成蛋白9，Bonemorphogeneticprotein,9,）及BMP13（骨形成蛋白13，Bonemorphogeneticprotein13）在体外对C3H10T1/2细胞向心肌样细胞分化的影响。方法：实验分组如下：空白组（未处理的C3H10T1/2细胞），GFP组的（AdEasy-GFP转染的C3H10T1/2细胞），BMP9组（AdEasy-BMP9转染的C3H10T1/2细胞），BMP13组（AdEasy-BMP13转染的C3H10T1/2细胞），心肌细胞组（新生C3H小鼠的原代心肌细胞）。实验检测选取1周，2周，3周，4周四个时间点。利用实时荧光定量PCR检测各组细胞心肌特异性基因MEF2C，GATA4及离子通道相关编码基因KCNA5，KCNJ12，CACNA1H，SCN5A的表达情况及差异；利用免疫荧光（Western-blot）和免疫印迹（Immunofluorescence）技术测定各组细胞肌钙蛋白T（cTnT）、缝隙连接蛋白（Cx43）的是否有表达及其表达的差异；利用透射电镜和马松三色染色观察各组细胞是否存在类似心肌特异性超微结构的表达；利用全细胞膜片钳技术检测各组细胞膜上是否存在分别由钙通道介导的钙电流，、钠通道介导的钠电流及钾通道介导的内、外向钾电流表达，同时利用实时荧光定量PCR测定介导各种电流的离子通道编码基因的表达差异。结果：1.通过随机分组后培养的各组细胞于倒置相差显微镜下观察，与空白对照组相比，经过BMP9，BMP13诱导的C3H10T1/2细胞更多呈长梭形，连接更为紧密，排列更为有序一致。2.利用实时荧光定量PCR（Real-timequantitativepcr）检测各组细胞心肌特异性基因MEF2C及GATA4的表达差异。实验结果表明于诱导分化后1周开始，就可以检测到BMP9组和BMP13组心肌特异性基因MEF2C,GATA4的表达，分别为GFP组和空白组的3倍和2.5-3.5倍(p<0.05)。BMP9组和BMP13组离子通道相关编码基因KCNA5，KCNJ12，CACNA1H的表达，分别为GFP组和空白对照组的3-3.5倍，1.5-4倍和2-6倍(p<0.05)；BMP9组中的SCN5A为BMP913组，GFP组和空白组的4.5倍。(p<0.05)3.免疫荧光和免疫印迹技术测定各组细胞肌钙蛋白T（cTnT）、缝隙连接蛋白（Cx43）的表达及其差异。经免疫印迹技术检测各组细胞中，GFP组和空白对照组无cTnT、Cx43表达，BMP9组，BMP13组和心肌细胞组的cTnT和Cx43表达量明显高于GFP组和空白组，且BMP9组表达高于BMP13组(p<0.05)。同样免疫荧光技术能够在检测BMP9组，BMP13组和心肌细胞组检测到cTnT和Cx43表达，GFP组和空白组无表达。4.透射电镜观察心肌特异性超微结构肌丝和闰盘的表达情况，和马松三色染色观察心肌特异性超微结构肌丝。利用透射电镜可以到观察与心肌细胞组一样，BMP9组及BMP13组有肌丝及闰盘样的结构，而GFP组和空白组无类似结构；马松三色染色可以观察到BMP9组，BMP13组有红染的肌丝样结构，而GFP组和空白组无类似结构。5.单细胞膜片钳检测各组细胞膜上的钙通道介导的钙电流、钠通道介导的钠电流及钾通道介导的内、外向钾电流表达。利用单细胞膜片钳检测1、2、3、4周四个时间点各组细胞膜电流的表达情况。在诱导分化后4周，可以在BMP9组，BMP13组检测到T型钙电流（IT‐Ca），超速激活延迟整流钾电流（Ikur），内向整流钾电流（Ikir）；仅在BMP9组少量细胞中可以检测钠电流（Ina）。上述电流均可在心肌细胞组中检测到，而GFP组和空白对照组均未能检测到上述电流。6.实时荧光定量PCR测定各种电流对应离子通道编码基因的表达差异。BMP9和BMP13组中，KCNA5的表达量是对照组的3-3.5倍（p<0.05），KCNJ12的表达量是对照组的1.5-4倍（p<0.05），CACNA1H的表达量是对照组的2-6倍（p<0.05），而BMP9组中SCN5A的表达量是对照组和BMP13组的4.5倍（p<0.05）。结论：BMP9和BMP13可以在体外培养的环境下促进C3H10T1/2细胞向心肌样细胞的分化，且BMP9的促分化作用优于BMP13。第三部分BMP9及BMP13转染后C3H10T1/2细胞对心梗后大鼠心功能的影响及其差异目的：研究并比较BMP9和BMP13对C3H10T1/2细胞在体内（SD大鼠心梗模型）向心肌样细胞分化及对心梗后SD大鼠的心功能的影响。方法：24只SD大鼠（全部选用雄性大鼠）随机分为四组：MI组（单纯心梗组，myocardialinfarction,n=6只），MI+GFP组（MI+pAdEasy-GFP转染C3H10T1/2细胞注射组，n=6只），MI+BMP9组（MI+pAdEasy-BMP9转染C3H10T1/2细胞注射组,n=6只），MI+BMP13组（MI+pAdEasy-BMP13转染C3H10T1/2细胞注射组,n=6只）。利用心脏彩色多普勒超声监测术前及术后4周LVEDD(左室舒张末期内径)，LVESD(左室收缩末期内径)，FS(左室短轴缩短率)以评估并比较各组大鼠的心功能；利用荧光显微镜观察各组大鼠心脏冰冻切片，寻找手术时植入的带有GFP绿色荧光示踪的各组植入细胞；利用苏木精-伊红（HE）染色观察细胞植入部位的组织细胞形态特点；马松三色染色观察并比较各组心梗面积；免疫荧光观察植入部位细胞心肌特异性蛋白肌钙蛋白T（cTnT）的表达情况。结果：1．心脏彩色多普勒超声提示术后4周，各细胞植入组心功能均有改善，MI+BMP9组，MI+BMP13组改善程度高于MI+GFP组，MI组，而MI+BMP9组高于MI+BMP13组（P<0.05）。2.荧光显微镜下观察各细胞植入组心脏冰冻切片，可见自带GFP绿色荧光示踪的植入细胞，多数沿血管分布。3.HE染色可见MI+BMP9组，MI+BMP13，组植入细胞大量聚集，排列较为整齐。4.马松三色染色提示三个细胞植入组的心脏切片心梗面积百分比均小于MI组（P<0.05）。但三个细胞植入组的心梗面积百分比差异无显著性（P>0.05）。5.免疫荧光可以观察到MI+GFP组，MI+BMP9组，MI+BMP13组植入部位心肌特异性蛋白cTnT表达较弱，且分布不均。结论：将BMP9、BMP13分别转染C3H10T1/2细胞后，再将分别植入SD大鼠心梗模型，可以促进心梗大鼠的心功能改善，且BMP9促进作用强于BMP13。
【作者】陈露；
【导师】陈沅；
【作者基本信息】重庆医科大学，儿科学，2014，博士
【关键词】BMP9；BMP13；HEK293；C3H10T1/2细胞；原代心肌细胞；心肌样细胞；离子通道；左室心功能；

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