海月水母响应环境低氧的分子机制研究

【摘要】河口、海湾及近岸海域出现的低氧区和海洋中大型胶质类水母的暴发严重威胁到渔业资源和海洋生态系统的健康。相对于其他海洋生物，水母类能够耐受低氧并且频繁出现在低氧水域，但是对此现象的机制性研究并不多见，尤其未见有关水母耐受低氧分子调控机制研究的报道。显然，要了解环境低氧与水母暴发的相互关系，就必须对水母类响应环境低氧的机制进行深入研究。针对水母类耐受低氧并且频繁出现在低氧水域的现象，本文以我国近海大型水母—海月水母为研究对象，通过构建低氧培养控制体系，以低氧诱导因子（HypoxiaInducibleFactor,HIF）为中心，对低氧环境下海月水母生理活性、有关基因表达和代谢产物的含量进行测定、比较和分析，以期揭示水母响应低氧的分子机制。研究获得的主要结果如下：1、证实了海月水母细胞内存在低氧诱导因子基因根据海月水母转录组测序获得了低氧诱导因子（HIF-1α）部分基因序列，通过RT-PCR和RACE技术获得HIF-1α基因2,466bp的全长cDNA，共编码675个氨基酸。对蛋白质功能结构域分析表明，海月水母HIF-1α含有bHLH、PAS、NODD、CODD和CTAD五个保守的功能结构域。以HIF-1α全长cDNA序列为基础，通过克隆、测序、拼接得到10,739bp的基因序列。通过与其他模式生物HIF-1α蛋白功能结构域和基因结构的比较发现，海月水母HIF-1α具有与高等动物类似的完整的氧依赖降解调控结构域（NODD、CODD和CTAD），然而结构域的组织形式和基因结构却更倾向于低等动物。2、在海月水母体内检测到HIF-1α蛋白的存在并证实该蛋白受环境低氧的诱导表达利用重组蛋白的体外表达技术成功获得约为75kDa的海月水母HIF-1α蛋白片段（融合蛋白），并通过免疫得到针对该蛋白片段的高效价特异性多克隆抗体。利用纯化的多克隆抗体，通过免疫印迹技术在海月水母体内检测到HIF-1α蛋白的存在并证实该蛋白受环境低氧的诱导表达。3、确定了用于低氧相关基因表达分析的内参基因通过对刺胞动物门肌动蛋白（actin）保守序列的分析，设计并合成其actin基因的简并引物。以海月水母cDNA为模板，通过克隆测序获得849bp的β-actin基因的部分cDNA序列。利用实时荧光定量PCR技术对海月水母18SrRNA、β-actin、α-tubulin和GAPDH四个候选基因在正常（对照组）和低氧条件下的表达量进行检测，通过内参基因筛选软件对它们进行分析筛选，最终确定α-tubulin基因作为海月水母耐受低氧分子机制研究的内参基因。以此为基础，建立了低氧耐受过程相关基因相对表达量分析的实时荧光定量PCR检测方法（RFQ-PCR）。4、研究了海月水母在低氧环境条件下的生理活性（伞部搏动）、脯氨酸羟基化酶-低氧诱导因子氧感受体系相关基因（PHD和HIF-1α）、能量代谢相关基因（ALDO、LDH和PDK）和HSP70基因的表达以及能量代谢产物（乳酸）含量随时间的变化规律，发现：（1）在0.5mg/L的低氧条件下，海月水母明显受到环境低氧的胁迫，进而表现出明显的低氧适应性，适应周期大约为30小时。由于培养体系中氧气的缺乏，海月水母的生理活性受到抑制，表现为海月水母伞部搏动的降低和HSP70基因相对表达量的急剧增加，但经过大约30个小时的机制转换和调节，会逐渐恢复到正常状态。（2）在海月水母适应低氧的过程中，脯氨酸羟基化酶-低氧诱导因子氧感受体系相关基因和物质能量代谢相关基因的相对表达量都在18小时出现峰值，说明此时海月水母在分子水平上响应低氧诱导和进行能量代谢机制的转换与调节最为活跃。（3）脯氨酸羟基化酶-低氧诱导因子氧感受体系在海月水母耐受并响应环境低氧的过程中起重要作用。对照组中HIF-1α和PHD基因的相对表达量较为稳定，而在低氧组中两者均呈现出先增高后降低的趋势，说明在分子水平上，海月水母细胞通过快速上调HIF-1α基因的转录而快速合成HIF-1α蛋白，该蛋白迅速结合到PHD基因的增强子区域，诱导PHD基因的转录。（4）低氧条件下，海月水母细胞内存在依赖于乳酸脱氢酶的无氧代谢过程。LDH基因的相对表达量和乳酸的含量随着低氧培养时间的延长逐渐升高，说明乳酸脱氢酶催化的可逆反应正在向乳酸方向进行。5、提出海月水母耐受并适应低氧环境的分子机制是脯氨酸羟基化酶-低氧诱导因子氧感受体系调控下的有氧代谢向无氧代谢的转换在低氧条件下，转录因子HIF-1α受低氧诱导表达并迅速结合到糖酵解各个关键酶基因（如ALDO和PDK）的增强子区域，诱导靶基因的增强表达，通过加速糖酵解提供的能量来维持海月水母的生理功能。转录因子HIF-1α进一步通过诱导LDH基因的表达将在细胞内由于糖酵解加速而累积的丙酮酸转化为乳酸，最终实现有氧代谢向无氧代谢的转换。6、提出低氧条件下海月水母转录因子HIF蛋白的大量表达可能是转录水平和翻译后水平共同作用的结果直接证实了HIF-1α在海月水母中存在转录水平上的调控。而对HIF-1α进行蛋白质功能结构域的分析则发现，海月水母HIF-1α含有氧依赖降解区（ODD区），其转录组中也存在PHD基因，而且在低氧条件下PHD基因的表达受HIF-1α的调控，这些都证明海月水母HIF-1α存在翻译后的调控。因此，低氧条件下海月水母转录因子HIF蛋白的大量表达可能是转录水平和翻译后水平共同作用的结果。本研究为分析海洋低氧与水母暴发的相互关系、解析控制水母暴发的关键环境因子提供了重要科学依据。
【作者】王国善；
【导师】于志刚；
【作者基本信息】中国海洋大学，海洋生物学，2014，博士
【关键词】海月水母；低氧；脯氨酸羟基化酶—低氧诱导因子氧感受体系；多克隆抗体；

【参考文献】
[1]戴海龙.论陈绍宽与民国海军[D].华中师范大学,中国近现代史,2014,硕士.
[2]唐一冰.基于电子政务发展要求的政府信息安全管理问题研究[D].长安大学,行政管理,2014,硕士.
[3]赵彦锋.基于HVS的DCT域数字水印算法研究[D].西安电子科技大学,计算机系统结构,2010,硕士.
[4]赵鸿雁.初中数学课程中研究性学习的研究与实施[D].首都师范大学,数学教育,2004,硕士.
[5]邢进生,刘人境,汪应洛,万百五.基于加工工序的高维多输入层神经网络及应用[J].系统工程理论与实践,2004,02:63-67.
[6]司云云.新型纳米制剂的研究—碳纳米管作为药物载体的分散特性[D].华东理工大学,2012.
[7]钦祥斗.稀土元素La对201不锈钢耐蚀性和力学性能的影响[D].内蒙古科技大学,材料学,2013,硕士.
[8]李新华.大跨度钢箱梁斜拉桥顶推施工中的关键技术研究[D].西南交通大学,桥梁与隧道工程,2013,硕士.
[9]王淑楠.阿尔茨海默病APPswe/PS1dE9双转基因小鼠的筑巢行为研究[D].华中科技大学,神经病学,2013,硕士.
[10]李强,戴启明.武钢热轧带钢厂精轧轧制压力数学模型研制成功[J].冶金自动化,1985,04:65.
[11]张玲.PDC钻头钻速方程的室内实验研究[D].东北石油大学,油气井工程,2013,硕士.
[12]孙海燕.DNA修复基因遗传多态性与上皮性卵巢癌患者铂类化疗临床预后关系的研究[D].河北医科大学,妇产科学,2013,硕士.
[13]张丽.中国社会保险基金监管制度的完善探析[D].吉林大学,公共管理,2013,硕士.
[14]刘娆,朱全胜,李卫东.新一代电力系统运行状态显示平台构想[J].电力系统自动化,2008,05:68-71.
[15]邓彤.微型化写作课程研究[D].上海师范大学,课程与教学论,2014,博士.
[16]王翔.Zyxin基因外显子SNP位点与京海黄鸡群体部分生产性能及肉品质的相关性研究[D].扬州大学,动物遗传育种与繁殖,2012,硕士.
[17]李莉.《文化社会学》（序及第一章）翻译报告[D].四川外国语大学,翻译（专业学位）,2013,硕士.
[18]高林.育苗生产线气吸式播种系统智能控制的研究[D].北京林业大学,2008.
[19]马金凤.运动分析及时空特性约束的单臂造影重建[D].华中科技大学,模式识别与智能系统,2013,硕士.
[20]郭威.基于ZigBee的无线智能路灯系统研究[D].北京交通大学,2014.
[21]周密.偶氮液晶功能化多壁碳纳米管及其复合材料的初步研究[D].湖南大学,2013.
[22]胡吉敏.均匀横流中有限长线源型倾斜正浮力射流的数值预报[D].河北农业大学,水利水电工程,2004,硕士.
[23]白合提尔·艾热提（BahtyarHairat）.基于欠发达地区干线公路快速化的灵活性设计策略研究[D].长安大学,道路与铁道工程,2014,硕士.
[24]陈昕怡.酒石酸绿色合成工艺研究与优化[D].浙江工商大学,食品科学与工程,2013,硕士.
[25]黄琴.Web数据挖掘的研究及其在网络学习个性化推荐中的应用[D].湖南大学,2004.
[26]张泰然,孙陆威,何海平,叶志镇.化学法制备水溶性良好的石墨烯及其荧光淬灭应用[J].材料科学与工程学报,2013,04:484-488.
[27]廖春燕.邻烯丙基酚/己二胺型苯并噁嗪的制备与性能研究[D].河北大学,材料物理与化学,2014,硕士.
[28]邢飞卓.艺术的表现：内心情感世界的开掘[D].南京师范大学,外国语言学及应用语言学,2012,硕士.
[29]胡晓.特定冒犯情境下宽恕身份凸显性对大学生宽恕倾向的影响[D].华中科技大学,发展与教育心理学,2012,硕士.
[30]江维.植酸酶appA NR基因在克鲁维乳酸酵母中的表达及酶学性质分析[D].湖北大学,微生物学,2012,硕士.
[31]姜莉莉.催化氧化处理含氰废水的研究[D].大连工业大学,环境工程,2008,硕士.
[32]金小峥,杨光红,常晓恒,车伟伟.容错控制系统鲁棒H_∞和自适应补偿设计[J].自动化学报,2013,01:31-42.
[33]李薇.企业社会责任与企业经营风险、个股系统风险的关系研究[D].西南交通大学,企业管理,2014,硕士.
[34]徐道钫.漫谈现代化交通[J].上海建设科技.1996(02)
[35]李诗然.卡尔·尼尔森《长笛协奏曲》赏析[D].西安音乐学院,长笛演奏,2014,硕士.
[36]褚士兵.石墨烯材料上储氢的第一性原理研究[D].兰州大学,2014.
[37]刘侃侃.上市公司股利政策受公司生命周期彩响吗？[D].杭州电子科技大学,会计学,2014,硕士.
[38]及华,关军锋,冯云霄,李丽梅,孙玉龙.温度和包装对巨峰葡萄贮藏品质的影响[J].食品与发酵工业.2006(01)
[39]赵宇.基于动态规划的检测前跟踪算法研究[D].西安电子科技大学,信号与信息处理,2012,硕士.
[40]张鹏.我国法律文本中的权利性条款规范化设置研究[D].山东大学,法学理论,2014,博士.
[41]李志强.论刑法上的财产占有概念[D].清华大学,民商法学,2003,硕士.
[42]覃凯.区域内医疗机构服务效率及设置规划研究[D].山西医科大学,社会医学与卫生事业管理,2003,硕士.
[43]曹俊英.汉语“比”字句教学研究[D].吉林大学,汉语国际教育,2013,硕士.
[44]浦溯.基于剩余收益模型的电信运营企业价值研究[D].北京交通大学,2014.
[45]王丽丽.基于语料库的词汇教学在对外汉语教学中的应用研究[D].上海外国语大学,汉语国际教育,2013,硕士.
[46]胡浩.水墨动画的研究与实践[D].吉林艺术学院,设计艺术学,2012,硕士.
[47]王军杰.罗尔斯正义观研究[D].西南大学,外国哲学,2013,硕士.
[48]谢国龙.白芍总苷对小鼠溃疡性结肠炎的疗效观察和机制研究[D].川北医学院,内科学,2013,硕士.
[49]谢雨.论专题图书馆建设与图书馆核心竞争力[D].安徽大学,图书馆学,2013,硕士.
[50]张晓阳.金华典型电镀废水处理实验研究与工程实施[D].浙江工业大学,2012.