单环刺螠硫化物应激数字基因表达谱分析及硫双加氧酶功能研究

【摘要】硫化物（H2S,HS-和S2-的总称）是环境中常见的有毒物质，可对生物体产生多种损伤甚至导致死亡。然而，人们发现一些海洋无脊椎动物具有耐受、代谢甚至利用硫化物的能力。为了探知生物在这一过程中的分子机制，本实验选用我国黄渤海沿岸底质中生活的一种耐硫生物单环刺螠Urechisunicinctus为研究对象，采用数字基因表达谱技术分析了硫化物应激下其在转录组水平的表达特征；进一步采用多种分子生物学技术，对单环刺螠线粒体硫化物氧化关键酶——硫双加氧酶的表达特征和功能进行了分析。主要结果如下：本文采用NlaIII和MmeI双酶切的方法，构建了单环刺螠50μM硫化物应激下4个时间点（0h、6h、24h和48h）的21bp标签测序文库；利用Solex/Illumina测序平台总共获得超过1600万个标签；去除杂质数据后获得高质量标签的数量分别是3,909,160（0h）、3,613,737（6h）、4,057,279（24h）和4,027,932（48h）；其中高质量标签能够比对上参考的单环刺螠转录组（NCBI注册号：SRA122323）中的基因数目分别为21,121（0h）、20,526（6h）、20,129（24h）和20,111（48h）。与0h的表达谱相比，单环刺螠暴露在50μM硫化物中的差异表达基因个数分别是1705（6h）、1181（24h）和1494（48h）。GO分析发现，这些差异表达基因大部分属于分子功能类别中的结合和催化活动亚功能组分、生物过程类别中的细胞过程和代谢过程亚功能组分以及细胞组成类别中的细胞组成和胞内组分亚功能组分。差异表达的基因在硫化物处理6h、24h和48h的单环刺螠中分别影响了176、166和176个信号通路；在pathway富集分析中发现氧化磷酸化、核糖体、蛋白酶体、补体系统和代谢通路在3个硫化物应激数字基因表达谱（硫化物处理6h、24h和48h）中均为差异表达基因显著富集的信号通路，其中核糖体、补体系统和蛋白酶体等信号通路为本实验首次发现与硫化物应激相关。进一步对能量代谢、DNA损伤应答和炎症反应所涉差异基因的表达进行了分析，发现在硫化物应激条件下，单环刺螠的糖酵解通路和氧化磷酸化被硫化物抑制，结合大部分线粒体硫化物氧化相关基因的上调表达，提出线粒体硫化物氧化既能进行硫化物氧化解毒又是单环刺螠硫化物环境下提供能量的主要通路；在硫化物应激条件下单环刺螠通过上调PIDD基因的表达，并与NF-κB通路和细胞凋亡通路协作降低硫化物对其DNA的损伤；此外单环刺螠在硫化物刺激下还能通过激活通路Toll-like受体4通路和ERK通路同时抑制补体系统，促进炎症反应和维持自身内环境的平衡，进而使其在硫化物环境中正常生存。本实验首次在多细胞生物中利用数字基因表达谱技术在转录组水平下揭示了硫化物应激相关基因的表达模式。本实验对单环刺螠硫双加氧酶的序列特征研究结果显示：其cDNA长度为1976bp，编码293个氨基酸，推测的氨基酸序列中含有金属β内酰胺酶超家族的保守序列。利用原核表达系统获得单环刺螠硫双加氧酶野生型重组蛋白，复性后测其比酶活为0.80Umgprotein-1。体外原核表达了4个硫双加氧酶删除型重组蛋白；通过酶活测定、酶特性分析和谷胱甘肽结合分析等方法，确定单环刺螠硫双加氧酶中的金属离子与其氨基酸序列中的金属结合位点（IH113,H115,H169和D188）结合，而其序列中的金属结合位点II（D117,H118,H169和H229）并不结合金属离子，但对其酶活的维持具有重要作用；D117E和H118A双突变蛋白的酶活结果揭示金属结合位点II中的D117和H118是维持硫双加氧酶酶活的两个关键氨基酸。此外，单环刺螠硫双加氧酶谷胱甘肽结合位点R197、Y231、M279和I283中，以Y231最重要。利用单环刺螠硫双加氧酶野生型体外重组蛋白制备多克隆抗体；westernblot检测其在线粒体中表达；免疫组织化学检测其主要位于各器官的上皮组织中。采用定量RT-PCR，westernblot和间接竞争性ELISA技术，在mRNA和蛋白水平下确定单环刺螠硫双加氧酶的表达存在器官差异，其中肛门囊中表达最高，中肠次之，体壁和后肠最低；各器官的硫双加氧酶总比酶活以体壁和中肠高于后肠和肛门囊，但不存在显著性的器官间差异。为了研究单环刺螠硫双加氧酶对硫化物的适应模式，我们在实验室模拟硫化物环境中处理单环刺螠，对各器官硫双加氧酶的表达特征和酶活性变化进行了分析。结果显示：硫双加氧酶在不同器官中呈现不同的硫化物应激后的适应性变化。在低浓度硫化物（50μM）条件下，单环刺螠体壁最先启动硫化物的氧化解毒，但随着暴露时间的延长后肠和体壁共同成为单环刺螠应对硫化物的器官，肛门囊的作用次之，中肠未表现出对硫化物显著性的应激反应。在高浓度硫化物（150μM）条件下，单环刺螠除了后肠外的各器官其硫双加氧酶的总比酶活均出现增加的现象，但是起始发生显著性提高的时间均呈延后特点，体壁在硫化物应激时发挥了重要的氧化解毒作用，其次是肛门囊和后肠，而中肠在硫化物应激解毒中的作用仍有限。因此单环刺螠体壁、后肠和肛门囊硫双加氧酶在硫化物应激时均发挥了重要的氧化解毒作用，而中肠硫双加氧酶在硫化物应激解毒中的作用较低。
【作者】张立涛；
【导师】张志峰；
【作者基本信息】中国海洋大学，细胞生物学，2014，博士
【关键词】单环刺螠；硫化物；硫双加氧酶；数字基因表达谱；

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