编码nAChR亚基基因的多态性分布对肺、食管癌发生、发展及吸烟行为影响的实验研究

【摘要】研究背景和目的食管癌是一种全球常见的恶性消化道肿瘤。据国际癌症研究中心(IARC)数据统计,在2008年,全世界食管癌新发病人数为482300例,是全球最常见的八大恶性肿瘤之一：食管癌死亡人数是406800例,是世界六大致死性肿瘤之一。我国是食管癌的高发地区,其死亡率排在肺癌、胃癌和肝癌之后,位居我国所有恶性肿瘤第四位。食管癌主要有鳞状细胞癌和腺癌两种病理类型,在世界范围内,食管鳞状细胞癌的发病率略高于腺癌。其中,腺癌主要发病于欧洲裔白人居住地区,而在包括我国在内的东亚国家,食管癌主要以鳞状细胞癌为主。食管鳞癌的发病机制复杂,目前尚未完全了解,但流行病学和临床研究已证实吸烟和饮酒是导致食管鳞癌发病的最重要的环境因素。国际癌症研究中心归类烟草和酒精为Ⅰ类致癌物,即那些有足够证据证明其致癌性的物质。烟草、酒精作为食管鳞癌的致癌物质可以在人体内被代谢,而体内与烟草和酒精等致癌物质相关的基因由于存在基因多态性,导致其可能对食管鳞癌的发病产生重要作用,从而成为影响食管鳞癌发病的重要遗传因素。2009年,Cui等对日本食管鳞癌病人进行全基因组范围的肿瘤相关基因的鉴定研究(GWAS),发现位于乙醇脱氢酶基因1B(ADHIB)和乙醛脱氢酶基因2(ALDH2)上的基因多态性可以影响食管癌的发生,而乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶便是参与酒精代谢的两种重要的酶。基因多态性是指在一个生物群体中,同时存在的两种或两种以上不连续的变异型、基因型或者等位基因。根据对基因多态性研究的顺序,通常可以将其分为三类,分别是限制性片段长度的多态性(RFLP)、DNA重复序列的多态性(RSP)和单核苷酸多态性(SNP)。这三类基因多态性均可以反映个体遗传病的易感性差异,为遗传相关疾病的研究和临床诊断提供帮助。目前,SNP,即在基因组内由于单个核苷酸——A、T、C或G的改变而形成的基因多态性,由于具有分布密度高、稳定性好、分型检测易于操作等优势,在遗传疾病的基因鉴定方面发挥重要作用。尼古丁乙酰胆碱受体(nAChR)属于配体门控的离子通道蛋白超家族,它可以被乙酰胆碱、胆碱和尼古丁等物质活化。nAChR同时具有参与亚硝胺和尼古丁调节的能力。一方面,亚硝胺是烟草导致多种吸烟相关肿瘤发生的重要致癌物质,现已证实与nAChR高亲和力的亚硝胺NNN参与人类食管鳞癌的发病过程；另一方面,烟草中的尼古丁是吸烟成瘾的物质基础,可以启动与吸烟消耗和吸烟成瘾性相关的心理和神经生物学作用。此外,nAChR通路还被认为同肿瘤细胞的增殖、凋亡、生存、迁移、侵袭和血管生成有关,这导致其可能影响癌症病人的疾病发展。因此,nAChR可能同时具有影响肿瘤发生、发展及吸烟者吸烟行为的作用。CHRNA5-CHRNA3-CHRNB4(CHRNA5-A3-B4)是编码nAChRα5、α3和β4亚基的一组基因簇。最近,在筛选肺癌易感基因的全基因组关联研究中发现,位于CHRNA5-A3-B4基因簇上的多个SNP位点的分布同欧洲裔白人肺癌发生风险相关,此外,其还可以影响吸烟人群的尼古丁依赖性、每天吸烟支数(CPD)和包年(pack-year)等吸烟行为。然而,通过对HapMap数据库进行检索发现,这些SNP位点在亚洲人群中变异率极低,即使它能够影响肺癌的发生,但是其作用远远小于在欧洲裔白人肺癌患者中的作用。随后,我国学者对该基因簇的多态性位点进行广泛筛选,发现位于CHRNA5-A3-B4基因簇上的rs667282和rs3743073位点可以影响我国肺癌的发生。本实验通过病例对照研究观察rs667282和rs3743073多态性位点基因型在食管鳞癌病例组和健康对照组的分布差异,分析CHRNA5-A3-B4基因多态性对于食管鳞癌发生的影响,并同时探讨CHRNA5-A3-B4基因多态性与食管鳞癌发展的关系及对吸烟者吸烟行为的影响。材料与方法研究对象为食管鳞癌患者866人和健康对照组人群952人,所有研究对象之间无血缘关系,祖籍均为山东省,汉族。病例组人群收集自山东大学齐鲁医院、山东省肿瘤防治研究院和山东大学第二医院,均为病理组织学确诊的原发性食管鳞状细胞癌；对照组收集自山东大学齐鲁医院健康查体中心,排除恶性肿瘤病史。收集所有研究对象的血液标本后提取基因组DNA。由统一培训的医务人员或医学院在读研究生进行面对面的访谈进行资料采集,并填写统一的调查问卷,问卷内容主要包括参与者的年龄、性别、是否饮酒、是否吸烟、吸烟时间和每日吸烟支数等问题。通过TaqMan探针成功分型SNP位点rs667282和rs3743073,测序验证分型的准确性。使用多元logistic回归模型分别分析2个SNP位点的基因型在食管鳞癌病例组和健康对照组的差异,研究CHRNA5-A3-B4基因多态性对食管鳞癌发生的影响：使用卡方检验分析SNP位点的基因型同食管鳞癌组织学分级和临床分期的相关性,探讨CHRNA5-A3-B4基因多态性对食管鳞癌发展的影响；使用Kruskal-Wallis检验分析rs667282及rs3743073位点的基因型在吸烟人群的每天吸烟支数和包年等吸烟行为方面的不同,探讨CHRNA5-A3-B4基因多态性对吸烟行为的影响。结果(1)CHRNA5-A3-B4基因多态性对食管鳞癌发生的影响Rs667282位点的基因型频率分布在对照组和病例组人群差异明显,其TT和TC基因型在病例组的频率明显高于对照组,而rs3743073位点的基因型频率分布并没有存在这种差异。通过多元Logistic回归校正对食管鳞癌发生有影响的混杂因素,发现rs667282位点的TT/TC基因型与食管鳞癌的发生显著相关(OR=1.32[1.03-1.69],P=0.029),提示CHRNA5-A3-B4基因簇rs667282位点的T等位基因是食管鳞癌发生的独立风险因素。而rs3743073位点则没有显示出与食管鳞癌发生存在明显关联(P>0.05)。根据不同的年龄、性别、吸烟、饮酒情况,对rs667282位点与食管鳞癌发生的相关性进行分层分析,发现rs667282TT/TC基因型对食管鳞癌发生的影响在年轻人群中(≤60岁)更为明显(OR=1.44[1.04-1.98],P=0.024)。(2)CHRNA5-A3-B4基因多态性对食管鳞癌发展的影响rs667282位点的TT/TC基因型与食管鳞癌的临床分期存在临界统计学意义的相关性(OR=1.30[0.78-1.85],P=0.137),但与组织学分级的关系无统计学意义。本次研究未发现rs3743073位点与食管鳞癌病人组织学分级或临床分期存在相关性。(3)CHRNA5-A3-B4基因多态性对吸烟行为的影响rs667282TT/TC基因型的吸烟者每天吸烟支数的均值是23.1[22.3-24.0],包年数的均值是36.3[34.7-47.8],均高于rs667282CC基因型吸烟者的每天吸烟支数均值21.5[19.9-23.2]和包年数均值34.6[31.6-37.6],但是差异尚无统计学意义(P>0.05)。rs3743073GG/TG基因型的吸烟者每天吸烟支数的均值是23.1[22.2-24.0],包年数的均值是36.0[34.4-37.5],相比于rs3743073TT基因型吸烟者的每天吸烟支数均值22.0[20.6-23.2]和包年数均值35.7[32.9-38.4]无明显差异。结论CHRNA5-A3-B4rs667282位点的TT/TC基因型是食管鳞癌的发生的危险因素,其与食管鳞癌的临床分期可能也有一定关联。而CHRNA5-A3-B4基因簇对我国吸烟人群吸烟行为的影响可能需要进一步研究。研究目的肺癌是全球最常见的致死性癌症之一。2008年,全世界约有160万新发肺癌患者,另外大概140万人因肺癌而死亡。非小细胞肺癌(NSCLC)患者人数约占所有原发性肺癌患者人数的80%,而多数NSCLC患者在确诊时便已达晚期(Ⅲ期或Ⅳ期)。即便接受放疗和化疗,晚期NSCLC患者的预后情况依旧很不理想,5年生存率甚至不足15%。过去一般基于肺癌患者的吸烟状态、机体表现(PS)评分和TNM分期等临床情况评估患者预后情况。最近大量研究显示遗传因素也与晚期肺癌患者的生存时间密切相关。尼古丁乙酰胆碱受体(nAChRs)是影响肺癌发生和发展的重要因素。全基因组关联研究发现编码nAChR亚基的两组基因簇(CHRNA5-A3-B4和CHRNB3-A6)上的多态性位点同肺癌的发生显著相关。本实验希望进一步研究这两组基因簇上的多态性位点同晚期NSCLC生存时间的关系,以探讨它们对肺癌发展的影响。研究方法本次研究共收集165名ⅢB期及Ⅳ期NSCLC患者,采集所有患者临床病理资料及生存资料。本次研究中NSCLC患者的总生存期(OS)被定义为从完成第一次治疗的时间至最后一次随访或患者死亡(无论任何原因)的时间。通过Taqman探针分型位于CHRNA5-A3-B4基因簇的rs667282和rs3743073位点及位于CHRNB3-A6基因簇的rs13280604位点。使用Kaplan-Meier法绘制生存曲线图,通过log-rank检验比较不同生存曲线间的差异；使用Cox回归模型校正影响肺癌患者生存的混杂因素,计算风险比(HR)来评估各SNP位点风险基因型对晚期NSCLC患者生存的影响。研究结果携带CHRNA5-A3-B4rs667282TT/TC基因型患者中位总生存期为11.7个月,明显短于携带rs667282CC基因型患者的18.2个月(log-rankP=0.043).多变量Cox回归分析发现rs667282TT/TC基因型是影响肺癌生存时间的独立风险因素(HR=1.64[1.03-2.61],P=0.038).本次研究未发现rs3743073和rs13280604位点的基因型分布同晚期NSCLC患者的总生存期存在联系。NSCLC患者的3个SNP位点基因型频率分布在不同的年龄、性别、吸烟状态、EGOGPS评分、组织学类型、临床分期和治疗方式等方面均无明显差异。研究结论CHRNA5-A3-B4rs667282位点的多态性分布可以影响晚期NSCLC的预后情况,而CHRNA5-A3-B4rs3743073位点和CHRNB3-A6rs13280604位点同晚期NSCLC预后的关系需要进一步研究。
【作者】王阳；
【导师】胡立宽；
【作者基本信息】山东大学，肿瘤学，2014，博士
【关键词】食管鳞癌；CHRNA5-A3-B4；吸烟；基因多态性；CHRNB3-A6；肺癌；生存；

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