脂多糖预处理对脊髓损伤大鼠神经细胞抗凋亡的作用及相关机制研究

【摘要】第一部分脂多糖预处理对大鼠脊髓损伤修复作用的实验研究目的：本实验分别采用改良Allen’s及NYU重物打击法复制大鼠创伤性脊髓损伤模型，通过低剂量LPS预处理诱导免疫交叉耐受，观察LPS预处理对脊髓损伤的抗凋亡及功能康复作用，进一步研究LPS预处理对转录因子Nrf2表达的影响，为LPS诱导中枢神经系统免疫耐受提供新的实验基础和理论依据，同时为脊髓损伤提供一种新的预防和治疗靶点。方法：（1）132只成年健康SD大鼠被随机分为3组：假手术组（n=12）、模型组（n=60）及LPS预处理组（n=60）。采用改良Allen’s打击法制作急性脊髓损伤（acutespinalcordinjury,ASCI）模型，在术后1、3、5、7d进行BBB评分；在建模后6、12h、1、3、5、7d获取损伤段脊髓标本，HE染色观察其组织病理学变化，Nissl染色观察神经元中尼氏小体的变化，免疫组织化学染色（IHC）定位观察损伤段脊髓中Nrf2及caspase-3的表达变化规律，Westernblotting法分析损伤段脊髓中Nrf2表达变化规律。（2）72只成年健康SD雌性大鼠被随机分为4组（n=18/组）：假手术组、对照组、LPS预处理组及甲强龙组。采用标准化NYU打击法（NewYorkUniversityimpactor）制作创伤性脊髓损伤模型，各组在术后6、12、24、48、72h进行BBB评分；在建模后72h获取损伤段脊髓标本，HE及Nissl染色观察损伤组织神经病理学变化，透射电镜及TUNEL法检测脊髓损伤后神经细胞凋亡变化，免疫组化染色定位观察损伤段脊髓中Nrf2、caspase-3、Bax及Bcl-2的表达变化，Westernblotting法分析损伤段脊髓中Nrf2、caspase-3、cleavedcaspase-3、Bax及Bcl-2的表达变化。结果：（1）模型组和预处理组术后1、3d大鼠BBB评分都有明显降低，5、7d时预处理组BBB评分明显高于模型组（P＜0.05）；6、12、24h时HE和Nissl染色显示模型组和预处理组脊髓有广泛性出血，大量红细胞渗出，间质水肿严重，核固缩，神经元数目明显减少，细胞体积变小，尼氏体模糊、碎裂。假手术组大鼠脊髓组织低表达Nrf2及微量表达caspase-3；1、3、5和7d时，与模型组相比，预处理组形态学损伤明显减轻，Nrf2蛋白表达明显增强（P＜0.01，P＜0.05），caspase-3阳性细胞数明显降低（P＜0.01，P＜0.05）。（2）与对照组相比，24、48、72h预处理组BBB评分显著提高（P＜0.05）；而预处理组与甲强龙组相比，两组各时间点BBB评分无统计学差异。与对照组和甲强龙组相比，损伤后72h预处理组损伤段脊髓的形态学变化明显改善，同时透射电镜及TUNEL染色显示预处理组损伤脊髓组织中神经细胞凋亡显著降低（P＜0.01）。IHC和Westernblotting分析显示：与对照组和甲强龙组相比，损伤后72h预处理组损伤脊髓组织中凋亡蛋白caspase-3、cleavedcaspase-3及Bax的表达明显降低，而转录因子Nrf2和抗凋亡分子Bcl-2的表达显著升高。结论：低剂量LPS预处理具有抑制脊髓损伤组织中炎细胞集聚、神经胶质细胞增生及神经元凋亡的生物学效应，这可能是其促进神经损伤修复，发挥神经保护效应的机制之一。低剂量LPS预处理能够对创伤性脊髓损伤发挥保护作用，且该作用与其激活转录因子Nrf2，调控凋亡相关因子caspase-3、cleavedcaspase-3、Bax及Bcl-2的表达，抑制神经细胞凋亡有关，这可能是LPS诱导中枢神经系统耐受性保护的又一相关机制。第二部分大鼠脊髓组织siRNA转染及ERK、Nrf2基因沉默效果评价目的：检测局部椎管内注射法转染siRNA进入大鼠脊髓组织的转染效果，并应用RT-PCR及Westernblotting技术检测大鼠局部脊髓组织中ERK及Nrf2蛋白分别进行RNA干扰后的沉默效果，为后续实验提供材料。方法：成年健康雌性SD大鼠在实验动物中心饲养3天后，使用微量注射器将含荧光慢病毒载体的稀释液注射入脊髓T10水平背侧深约0.8mm，通过荧光显微镜观察不同时间点的转染效果。分别转染ERK及Nrf2的siRNA进入大鼠局部脊髓组织，转染后7d应用RT-PCR及Westernblotting技术检测RNA干扰后ERK及Nrf2基因的mRNA及蛋白表达情况。结果：与假手术组相比，模型组在慢病毒转染后各时间点脊髓组织中均有较强的荧光表达，且在3d和7d时慢病毒转染效果较明显。模型组在荧光慢病毒转染后，脊髓组织中荧光表达具有时间依赖性，且在转染后7d达到高峰。RT-PCR技术分别检测大鼠脊髓组织中ERK及Nrf2基因沉默效果显示，转染后7d假手术组与模型组中ERK基因mRNA的表达较转染前明显减少（P＜0.01，P＜0.05），同样在两组中Nrf2基因mRNA的表达也较转染前明显减少（P＜0.01）。Westernblotting技术分别检测大鼠脊髓组织中ERK及Nrf2基因沉默效果显示，转染后7d假手术组与模型组中ERK蛋白表达较转染前明显减少（P＜0.01，P＜0.05），同样在两组中Nrf2蛋白表达也较转染前显著减少（P＜0.01）。结论：局部椎管内注射法能够转染siRNA进入在体大鼠脊髓组织，应用RNA干扰技术能够有效沉默ERK及Nrf2基因的表达。第三部分脂多糖预处理对脊髓损伤大鼠神经细胞抗凋亡作用的机制研究目的：探讨脂多糖预处理对脊髓损伤神经细胞抗凋亡作用的分子机制及靶点，为后期临床实践及药物治疗提供实验依据。方法：（1）48只成年健康SD雌性大鼠，随机分为4组（n=12/组）。a：对照载体组；b：LPS+对照载体组；c：ERK1/2干扰组；d：LPS+ERK1/2干扰组。采用标准化NYU打击法制作创伤性脊髓损伤模型，各组大鼠在术后72h安乐死后获取损伤段脊髓标本，透射电镜观察神经元凋亡形态，TUNEL法观察脊髓损伤后神经细胞凋亡变化，免疫组织化学染色定位观察损伤段脊髓中Nrf2、HO-1、NQO1及GCLC的表达及分布情况，Westernblotting技术检测损伤段脊髓中总Nrf2、HO-1、NQO1及GCLC蛋白的表达变化，同时Westernblotting技术检测损伤段脊髓中胞浆及胞核Nrf2蛋白表达变化。（2）48只成年健康SD雌性大鼠，随机分为4组（n=12/组）。e：对照载体组；f：LPS+对照载体组；g：Nrf2干扰组；h：LPS+Nrf2干扰组。采用标准化NYU打击法制作创伤性脊髓损伤模型，各组大鼠在术后72h安乐死后获取损伤段脊髓标本，透射电镜观察神经元凋亡形态，TUNEL法观察脊髓损伤后神经细胞凋亡变化，免疫组织化学染色定位观察损伤段脊髓中HO-1、NQO1及GCLC蛋白的表达及分布情况，Westernblotting技术检测损伤段脊髓中HO-1、NQO1及GCLC蛋白的表达变化。结果：（1）透射电镜观察显示a、c两组损伤段脊髓组织中均有大量形态异常的凋亡神经细胞，出现神经元萎缩，胞质空泡化，染色质边集及核膜连续性中断等变化；而b组中神经元显示更少的形态异常及清晰的核膜结构。TUNEL染色显示与a及d组相比，b组脊髓组织中TUNEL阳性细胞数显著下降（P＜0.01）。与d组相比，免疫组织化学染色显示b组脊髓组织中Nrf2、HO-1及NQO1阳性细胞数明显增加（P＜0.01），但两组间GCLC阳性细胞数未见明显差异；与a组相比，b组中Nrf2、HO-1、NQO1及GCLC阳性细胞数均显著增加（P＜0.01，P＜0.05）。Westernblotting分析显示b组损伤段脊髓中胞浆Nrf2、胞核Nrf2、总Nrf2、HO-1及NQO1蛋白表达均较d组明显升高（P＜0.01），但GCLC蛋白表达在两组间无显著差异；而与a组相比，b组上述蛋白表达均显著增加（P＜0.01，P＜0.05）。（2）透射电镜及TUNEL染色显示e、g、h三组损伤段脊髓组织中有大量凋亡神经细胞，而f组脊髓组织中凋亡神经细胞数目明显减少（P＜0.01），且神经细胞形态及结构较完整。免疫组织化学染色显示与e及h组相比，f组脊髓组织中HO-1、NQO1及GCLC阳性细胞数均显著增加（P＜0.01）。Westernblotting分析显示f组损伤段脊髓中HO-1、NQO1及GCLC蛋白表达均较e、h两组明显升高（P＜0.01）；与e组相比，Nrf2基因沉默后g组HO-1及NQO1蛋白表达显著降低（P＜0.01，P＜0.05）。结论：低剂量脂多糖预处理可激活丝裂酶原途径中的ERK1/2分子，通过ERK1/2-Nrf2/ARE通路有效诱导脊髓组织产生交叉耐受性保护；该通路介导大鼠局部脊髓组织抗氧化因子表达，降低脊髓损伤组织继发性凋亡和炎症反应，保护神经元，促进神经功能康复。
【作者】李维朝；
【导师】蒋电明；
【作者基本信息】重庆医科大学，外科学，2014，博士
【关键词】脂多糖；Nrf2；预处理；细胞凋亡；脊髓损伤；

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