低氧诱导因子1α与系统性红斑狼疮相关性的分子流行病学研究

【摘要】研究背景系统性红斑狼疮（SystemicLupusErythematosus，SLE）是一种侵犯皮肤及多器官、临床表现复杂、病程迁延反复的自身免疫性疾病，对患者的身心健康造成较大危害，已经成为一个重要的公共卫生问题。近年来，SLE病因学研究发展迅速，在免疫、遗传、流行病学等领域均取得了一定进展。已有研究表明，辅助性T细胞（HelperTCell，Th）在SLE及其它自身免疫疾病的发病中起重要作用，活化的自身反应性Th细胞促使B细胞分化、产生自身抗体，包含自身抗体的免疫复合物和炎性Th细胞因子导致组织和器官损伤。低氧诱导因子-1（Hypoxia-InducibleFactor1，HIF-1）是一种异二聚体转录因子，1992年由美国Semenza等人首先发现，它由亚单位HIF-1α和HIF-1β组成。HIF-1α广泛表达于各种组织，既是HIF-1的调节亚基又是活性亚基，因此HIF-1的生物效应是由α亚基实现的。表达于T细胞中的HIF-1α，在低氧或非低氧的刺激下，均可以促进其mRNA表达的增加。已有证据显示，在炎症反应过程中，机体常需要“激活”HIF-1，以应对炎症过程中的低氧，而HIF-1本身也可通过调节免疫细胞而驱动炎症反应。在癌症、炎性肠炎和感染等炎症性疾病的免疫反应调节过程中，HIF-1均扮演了至关重要的角色。近年来本课题组和国内外的研究均发现，Th17细胞及其相关细胞因子参与了SLE的发病。与Th17细胞介导的炎症反应相对应，调节性T细胞（RegulatoryTCells，Tregs）则在维持外周耐受，压制自身反应性T细胞活性等免疫调节过程中扮演了至关重要的角色。在正常情况下Treg细胞和Thl7细胞的效应处于一种平衡状态，Treg/Thl7平衡失调在组织炎症和自身免疫性疾病等疾病的发生发展中具有重要作用。同时，SLE患者体内的调节性T细胞也存在着功能和数量上的异常。活化的Th17和缺陷的Tregs在SLE发病过程中起着重要作用。最近研究发现HIF-1α能激活RORγt（Retinoid-relatedOrphanNuclearReceptorγt，维甲酸相关孤核受体γt）的转录，从而促进Th17的增殖，并且可与RORγt、p300共同作用上调IL-17A基因表达；同时，HIF-1α通过介导转录因子Foxp3（foxheadboxprotein3，叉头样转录因子P3）降解而抑制Treg细胞的发育。这些研究提示Th17/Tregs分化平衡依赖于HIF-1α；阻断HIF-1α有可能减缓Th17细胞介导的自身免疫性疾病。表达/功能异常的HIF-1α是否可通过影响Th17/Tregs的平衡，导致炎性细胞因子的表达紊乱从而参与SLE的发病等问题尚有待于进一步探讨。在中国汉族人群尚无HIF-1α与SLE的关联研究。因此，本研究拟开展HIF-1α与SLE发病相关性的分子流行病学研究拟收集SLE患者和健康对照样本，应用RNA干扰技术沉默HIF-1基因，检测HIF-1基因Knockdown对SLE患者体内PBMC中细胞因子表达的调节作用，初步探讨HIF-1基因功能；采用ELISA等技术，检测SLE患者与对照血清中HIF-1α表达水平的差异，并分析其与SLE疾病活动度、临床亚型的关联；通过SequenomMassARRAY方法，分析HIF-1α基因多态性与SLE遗传易感性的关系，并进行独立验证。本研究分为三个部分。第一部分RNA干扰体外沉默SLE患者PBMC中HIF-1的影响及相关机制研究目的利用RNA干扰技术，构建HIF-1α-shRNA慢病毒载体，沉默SLE患者外周血单个核细胞（PBMC）中HIF-1基因表达，观察沉默效率并研究沉默后相关细胞因子表达水平变化，初步探索系统性红斑狼疮患者HIF-1的基因功能。方法收集SLE确诊且新发病例5例，患者符合美国风湿病学会1997年修订的SLE分类标准。采集研究对象外周血各40ml，分离PBMC。利用RNA干扰沉默HIF-1基因初步研究其基因功能，并分析HIF-lα与IL-17之间的相关性。采用脂质体转染法将LV-shRNA-HIF和LV-shRNA-HIF-NC同包装质粒和包膜质粒共转染到293T细胞中，获得重组慢病毒。采用慢病毒载体方法将LV-shRNA-HIF慢病毒感染SLE患者PBMC细胞，采用实时定量聚合酶链反应（Real-timePCR，RT-PCR）和蛋白质印迹法（Westernblot）检测构建成功的RNAi表达载体在mRNA及蛋白水平对目标基因表达的抑制，同时酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测HIF-1α和IL-17在培养上清中的表达水平。结果（1）实验组HIF-1沉默效率可达95%；（2）RT-PCR可见，实验组HIF-1基因mRNA表达丰度显著低于对照组（p<0.05）；（3）Westernblot可见，实验组HIF-1蛋白表达水平显著降低（p<0.05）；（3）实验组培养上清中HIF-1α浓度显著低于对照组（p<0.001）；（4）实验组培养上清中IL-17浓度显著低于对照组（p<0.001）；（5）实验组HIF-1α与IL-17显著正相关（r=0.959，p<0.001）。结论构建成功的RNAi表达载体可以有效抑制目标基因HIF-1在mRNA及蛋白水平的表达，沉默HIF-1基因后HIF-1α与IL-17表达水平显著正相关。第二部分HIF-1α血清学表达水平与SLE的相关性研究目的比较SLE患者与正常对照、类风湿性关节炎（RA）、原发性干燥综合症（pSS）和系统性硬化症（SSc）之间；狼疮肾炎（LN）患者和SLE未并发肾炎患者之间；SLE患者有无某临床症状之间以及活动期SLE患者和非活动期SLE患者之间HIF-1α血清学水平的差异，探讨HIF-1α水平与系统性红斑狼疮疾病活动度、IL-17水平的关联。方法收集149例确诊的SLE患者，102例健康对照者，疾病对照组由三种常见自身免疫疾病患者组成：46例RA患者；50例pSS患者和26例SSc患者。在获取研究对象知情同意后采用自行设计的问卷进行调查，同时抽取5ml非抗凝外周静脉血，分离血清，-80℃冻存留待检测。采用ELISA试剂盒检测血清HIF-1α和IL-17水平。数据录入采用Excel2007软件进行，统计分析采用SPSS10.01软件进行。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较符合正态分布且方差齐性者采用t检验，两组间定量资料相关性分析采用Pearson相关分析。检验水准α=0.05。结果（1）各组人口学资料分析149例SLE患者被纳入分析，其中141例女性，8例男性，年龄分布从9岁到65岁（32.5±10.9）。患者从出现症状到被纳入分析的时间（即采集血液并收集信息的时间）被定义为病程，从0到19.3年（3.7±4.2）。SLE患者的疾病活动度评分从1到44（12.0±7.9），81例患者为活动期病人，约占54.4%。（2）各组HIF-1α水平比较SLE患者血清HIF-1α水平为32.76±12.60pg/ml，健康对照组为23.04±11.35pg/ml，RA患者组为28.71±10.88pg/ml，pSS患者组为30.08±23.57pg/ml，SSc患者组为26.15±13.92pg/ml。两两比较分析发现，SLE组与健康对照组、SSc患者组有统计学差异（p值分别为：p<0.0001和p=003）；SLE组与RA患者组和pSS患者组无统计学差异（p值分别为：p=0.09和p=0.25）。同时，RA患者组和pSS患者组分别与健康对照组比较，差异具有统计学意义（p=0.02和p=0.004）。在SLE亚组分析中，SLE合并肾炎组血清HIF-1α水平为35.06±11.64pg/ml，非肾炎组为32.03±12.86pg/ml，两者之间无统计学差异（p=0.50），但是分别与健康对照组相比差异都具有统计学意义（p值均<0.0001）。SLE活动期患者血清HIF-1α水平为34.83±13.94pg/ml，非活动期患者组为30.31±10.38pg/ml，差异具有统计学意义（p=0.03）。对各临床症状阳性组与阴性组的血清HIF-1α水平进行分析，均没有统计学意义（p值均>0.05）。（3）相关性分析HIF-1α水平与SLE疾病活动度评分（SLEDAI）显著正相关（r=0.23；p=0.004）。同时，在SLE患者组，HIF-1α水平与IL-17水平正相关（r=0.53；p<0.0001），但是未发现其与SLE的病程之间的相关性（r=-0.02；p>0.05）。结论本研究发现SLE患者与健康对照组（HC组）、SSc患者组，狼疮肾炎、非狼疮肾炎患者与健康对照组（HC组），SLE患者疾病活动组与非疾病活动组之间HIF-1α表达水平有统计学差异，SLE患者与RA、PSS患者，狼疮肾炎组与非狼疮肾炎组之间未发现表达差异，SLE患者HIF-1α表达水平与SLEDAI、IL17水平存在相关，但未发现HIF-1α水平与SLE患者的部分临床特征之间存在关联。第三部分HIF-1基因多态性与SLE遗传易感性的相关性研究目的比较SLE患者和正常对照HIF-1基因（rs11549465、rs12434438、rs1957757、rs1951795和rs7143164）的基因型频率和等位基因频率，探讨其与中国汉族人群SLE易感性的关系，同时结合临床资料分析其与SLE主要临床特征之间的关系。方法病例组共1497例SLE患者，来自两所三甲医院的住院和门诊病例，均符合美国风湿病学会1997年修订的SLE分类标准；健康对照2296例，来自健康体检中心和健康献血者，均排除SLE和其他自身免疫疾病。收集研究对象的一般情况和病例的相关临床资料，采集所有研究对象的外周静脉血，提取DNA冻存。利用SequenomMassARRAY技术，检测五个位点的多态性；比较SLE病例组和对照组中各多态性位点的基因型和等位基因频率分布是否存在差异。采用SPSS10.01软件进行统计分析，以α=0.05作为检验水准。结果（1）哈德-温伯格平衡（Hardy-Weinbergequilibrium，HWE)检验：5个位点rs11549465、rs12434438、rs1957757、rs1951795和rs7143164的基因型分布在对照组中均达到遗传平衡。（2）HIF-1基因分型：五个位点的基因型频率和等位基因频率在病例组和对照组之间差异均无统计学意义（p>0.05）。（3）基因分型与主要临床特征的关系：分析rs11549465,rs12434438,rs1957757,rs1951795和rs7143164多态性与SLE主要临床特征潜在的易感性关联，结果显示在1497例SLE患者中各位点基因型与主要临床特征（碟状红斑、光敏感、口腔溃疡、狼疮肾炎、关节炎和神经系统异常等）均无统计学关联（p>0.05），与盘状红斑的有无存在统计学关联（p<0.05）。结论本研究表明在中国汉族人群中HIF-1基因多态性可能与SLE的易感性无统计学关联，HIF-1基因多态性与SLE患者有无盘状红斑首发症状存在统计学关联。
【作者】冯晨晨；
【导师】叶冬青；
【作者基本信息】安徽医科大学，流行病与卫生统计学，2014，博士
【关键词】系统性红斑狼疮；RNA干扰；基因沉默；低氧诱导因子-1；HIF-1α；血清学；疾病活动度；ELISA；HIF-1基因；单核苷酸多态性；遗传易感性；

【参考文献】
[1]余钱.河南花生产业发展研究[D].河南农业大学,农业经济管理,2012,硕士.
[2]杨召君.基于视频人数统计与跟踪改进算法的研究与实现[D].南京邮电大学,信号与信息处理,2013,硕士.
[3]李慧慧.社科论文常见语言文字问题及解决对策[D].黑龙江大学,汉语言文字学,2012,硕士.
[4]杨先功.ERP在大型有色企业中的应用研究[D].中南大学,2002.
[5]贾艳楠.金樱子总黄酮抗心脑血管疾病作用的初步研究[D].大连医科大学,药理学,2012,硕士.
[6]许强,赵宏,江早.一种新颖的智能网络图像内容监测系统模型[J].软件学报,2002,03:424-432.
[7]李牧航.我国房地产投资信托基金发展模式的研究[D].吉林财经大学,金融学,2014,硕士.
[8]郭延伟.河南鸡冠洞岩溶记录的氧同位素现代过程监测及机理研究[D].西南大学,第四纪地质学,2013,硕士.
[9]张体云.张栻与朱熹诗比较研究[D].湘潭大学,中国古代文学,2003,硕士.
[10]卓见.基于Kerberos的统一身份认证与授权管理系统设计与实现[D].北京邮电大学,信息安全,2013,硕士.
[11]曹晓晴.锂离子电池负极材料纳米Li_4Ti_5O_(12)的制备及其改性[D].东北大学,2014.
[12]李超.茵陈蒿汤合五苓散治疗湿疹的疗效及影响因素的logistic回归分析[D].北京中医药大学,中医学,2014,硕士.
[13]王俊仁.温针灸治疗30例强直性脊柱炎临床疗效观察[D].广州中医药大学,中医临床基础,2013,硕士.
[14]成丽媛.载药核—壳纳米纤维的制备及其应用研究[D].北京化工大学,材料科学与工程,2013,硕士.
[15]李庆华.从《史记》、《汉书》看汉代妇女地位及其成因[D].湘潭大学,专门史,2003,硕士.
[16]郭群强.提高白光LED色坐标对档率研究[D].厦门大学,电子与通信工程,2014,硕士.
[17]徐玮聪.网络意见领袖对消费者购买意向影响研究[D].东北师范大学,传播学,2012,硕士.
[18]李育林,朱春毅,牛东风,邱兆祥,李熙玉,朴庆利.潜油泵中压变频控制系统[J].冶金自动化,2002,05:31-33.
[19]钱济民.浅谈建筑市场管理综合信息发布系统的构建[J].金卡工程,2004,09:34-38.
[20]张小锐.啄食理论的个案研究[D].中国海洋大学,会计（专业学位）,2014,硕士.
[21]王腾.超声栓子信号的检测与分类研究[D].复旦大学,电路与系统,2012,硕士.
[22]张良仪,吴敏金.滤波器组合设计与参数优化[J].自动化学报,2002,04:513-519.
[23]徐用懋,张猛.流程工业的综合自动化技术[J].工业控制计算机,2002,11:5-10.
[24]何唱.施工项目精细化管理的应用研究[D].华中科技大学,工商管理,2013,硕士.
[25]李广军.东江湖区域公益林主要生态功能研究[D].中南林业科技大学,林业（专业学位）,2013,硕士.
[26]周月怀.充分竞争条件下单宗土地价格快速评估系统的设计与实现[D].电子科技大学,软件工程（专业学位）,2012,硕士.
[27]颜峰.郯城（重坊）方言研究[D].苏州大学,汉语言文字学,2003,硕士.
[28]胡晖.基于块匹配和随机蕨的电子稳像方法研究[D].华中科技大学,模式识别与智能系统,2013,硕士.
[29]陈霖,张小青.变压器型故障限流器限流效果研究[J].中国电力,2014,02:53-57.
[30]吕剑虹,徐治皋,陈来九.特征结构下的一种多变量预测控制方法[J].自动化学报,1992,05:565-572.
[31]王梦辰.谢肇淛《小草斋集》及《续集》研究[D].安徽大学,中国古代文学,2014,硕士.
[32]林治国.疏浚作业仿真训练器集中监控报警及优化系统[D].武汉理工大学,2003.
[33]尉小旋,陈景文,王如冰,郭芳婕,曾宇飞,李雨昕,吴英格.氧氟沙星和诺氟沙星的水环境光化学转化:pH值及溶解性物质的影响[J].环境化学,2015,03:448-454.
[34]周文海.基于ZigBee技术的塔机群防碰撞系统设计[D].华东交通大学,检测技术与自动化装置,2013,硕士.
[35]陶泓宇.XB物流公司人才规划研究[D].西南交通大学,工商管理,2012,硕士.
[36]沈辰飞,马路遥,郑明波,赵斌,邱旦峰,潘力佳,曹洁明,施毅.SnS_2/石墨烯纳米复合材料的合成以及在锂离子电池中的应用研究[A].中国化学会.中国化学会第28届学术年会第10分会场摘要集[C].中国化学会:,2012:1.
[37]陈雨霞.开关电源最优设计技术研究[D].浙江大学,电力电子与电力传动,2004,硕士.
[38]梁云峰.甲基氯硅烷分离序列综合优化研究[D].大连理工大学,化学工程,2004,硕士.
[39]王路燕.PFOS对黄海胆体内酶活及DNA甲基化的影响研究[D].大连海事大学,环境科学与工程,2013,硕士.
[40]林地明.用历史唯物主义观点重新认识《自由大宪章》的形成和实质[D].西南政法大学,马克思主义基本原理,2012,硕士.
[41]姜雪.无线传感器网络中多跳均匀分簇路由算法的研究[D].吉林大学,信号与信息处理,2014,硕士.
[42]史强.A/O工艺在高氮废水处理中的应用及优化[D].西南交通大学,环境科学,2014,硕士.
[43]言丽花.唐五代梦游小说研究[D].扬州大学,中国古代文学,2011,硕士.
[44]丁宏谦.水相中铁（Ⅱ）催化的不对称芳基脲的氧化反应[D].东北师范大学,有机化学,2012,硕士.
[45]牛禄青.新材料:下一个投资风口[J].新经济导刊,2015,05:60-62.
[46]张帆.事件风险下的商业银行汇率风险测量[D].上海交通大学,工商管理,2013,硕士.
[47]鄢发齐,徐玮,何毅斌,李晓红,陈磊,胡伟.互联系统交流联络线随机功率波动分析(二)原因分析与改进措施[J].电力系统自动化,2013,14:32-37.
[48]丁天.P2P网络借贷平台的法律问题探究[D].中国社会科学院研究生院,法律,2014,硕士.
[49]任刚.我国政府财务信息披露改进研究[D].财政部财政科学研究所,会计学,2014,博士.
[50]梁晓静,贾静,汤胜,刘霞,郭勇.新型固相微萃取材料和色谱分离材料研究[A].中国化学会色谱专业委员会、北京色谱学会.第十届全国生物医药色谱及相关技术学术交流会论文集[C].中国化学会色谱专业委员会、北京色谱学会:,2014:2.