活性氧介导的内质网应激在博莱霉素诱导上皮—间质转化及皮肤组织纤维化中的作用研究

【摘要】研究背景：硬皮病(Scleroderma)是一种以皮肤、血管和内脏器官发生广泛纤维化,同时针对自身抗原产生一系列自身抗体为特征的全身性结缔组织病。虽然目前仍对其发病机制尚不完全明确,但过量的ECM成分(尤其是胶原成分)在皮肤、内脏及血管周围沉积导致组织器官纤维化是该病的重要特征之一。一般认为在纤维化组织器官中胶原合成增加和降解减少导致机体正常的平衡遭到破坏可能是造成胶原过量沉积的重要原因之一。当机体组织受到内外源性因子作用后,成纤维细胞等将转化成具有收缩和强分泌功能的肌成纤维细胞,从而大量分泌胶原来修复组织损伤,当肌成纤维细胞分泌的ECM过量时,导致ECM在组织细胞间过量沉积,将会使组织器官发生纤维化,从而导致相应组织器官出现严重的功能障碍。近年来越来越多的临床研究和动物实验证据表明上皮细胞通过上皮-间质转化(Epithelial-mesenchymaltransition,EMT)导致肌成纤维细胞增加在组织纤维化中的发挥重要的作用。然而,启动上皮细胞发生EMT过程需要细胞外和细胞内因子刺激,从而启动相应的信号转导途径。近年来,越来越多的研究也显示活性氧介导的氧化应激和内质网应激可能也参与调控上皮细胞发生EMT过程。然而目前对于皮肤组织纤维化中是否发生EMT及其发生机制尚不完全清楚。研究目的：本研究通过对经皮下注射博莱霉素诱导BALB/c小鼠皮肤组织纤维化的硬皮病动物模型进行研究,探讨：(1)博莱霉素能否通过诱导皮肤上皮细胞发生上皮-间质转化导致肌成纤维细胞增加参与皮肤组织发生纤维化；(2)活性氧介导的氧化应激是否在博莱霉素经皮注射诱导皮肤上皮细胞发生EMT与组织纤维化中可能发挥一定的作用；(3)活性氧是否参与调控内质网应激,从而通过未折叠蛋白反应引发皮肤上皮细胞发生EMT及其分子机制。研究方法：(1)为探讨博莱霉素染毒后皮肤组织是否发生纤维化,通过取染毒部位皮肤组织,将组织处理后经H&E染色和天狼星红染色用于病理学观察皮肤厚度及胶原纤维含量变化,并且将新鲜的皮肤组织经碱裂解法裂解后用于羟脯氨酸含量检测来反映皮肤组织纤维化程度；(2)为探讨皮肤纤维化组织中上皮细胞是否发生EMT现象,通过病理学观察皮肤上皮细胞形态结构变化；并且将新鲜皮肤制备冰冻切片,利用免疫荧光检测上皮细胞特征蛋白E-cadherin和间质细胞特征蛋白Vimentin在皮肤表皮层上皮细胞中的表达；同时将新鲜皮肤组织制备匀浆后,利用蛋白质免疫印迹和RT-PCR检测E-cadherin和Vimentin蛋白及基因在皮肤组织中的表达；(3)为探讨皮肤纤维化组织中活性氧是否引起氧化应激,利用MDA含量反映脂质过氧化程度,利用羰基化合物的含量反映蛋白质的氧化损伤程度。同时利用黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统测量SOD酶活力,利用过氧化氢与钼酸铵反应系统测量CAT酶活力,利用GPX催化GSH的反应速度来表示GPX活性,通过检测GSR催化NADPH的改变来反映GSR活力,来反映多种抗氧化酶活性变化；(4)为探讨皮肤纤维化组织中细胞是否发生内质网应激及未折叠蛋白反应,利用蛋白质免疫印迹检测内质网应激特征性蛋白Bip及活化的未折叠反应蛋白pIRE1α在皮肤组织中的表达；并且利用透射电子显微镜观察基底层上皮细胞内质网结构变化,探讨皮肤表皮层中基底膜带附近上皮细胞是否发生内质网应激；(5)为探讨内质网应激在诱导皮肤上皮细胞发生EMT中的分子机制,采用化学伴侣PBA来干预内质网应激的生物学效应,利用蛋白质免疫印迹定量检测活化状态pSmad2/3和pSrc蛋白在皮肤组织中的表达情况,探讨Smad和Src激酶信号通路在内质网应激诱导上皮细胞发生EMT过程中作用；(6)为探讨活性氧是否是博莱霉素诱导内质网应激介导皮肤上皮细胞发生EMT和组织纤维化的上游信号,采用抗氧化剂NAC来干预活性氧介导的生物学效应,利用蛋白质免疫印迹检测Bip蛋白和pIRE1α在干预后皮肤组织中的表达水平,利用蛋白质免疫印迹检测E-cadherin和Vimentin在干预后的皮肤组织中的表达,同时利用H&E染色和天狼星红染色用于病理学观察来反映干预后皮肤厚度及胶原纤维含量变化。实验结果：(1)博莱霉素经皮注射染毒后导致染毒部位皮肤弹性明显下降,皮肤出现变硬,皮层厚度增加,并且染毒部位皮肤毛发生长缓慢或难以再生,同时博莱霉素组小鼠体重随着染毒时间延长呈明显下降趋势。取染毒部位皮肤采用H&E染色和天狼星红染色后病理学观察结果显示,随着染毒时间的延长皮肤组织表皮和真皮层厚度及胶原纤维含量明显增加,并且观察到炎性细胞在真皮层中浸润的数量也明显增加,皮肤厚度随染毒时间呈明显的时间-效应关系,同时皮肤厚度和胶原纤维含量在染毒2wks就开始与对照组之间差别具有统计学意义。皮肤组织中羟脯氨酸含量检测结果也显示,博莱霉素染毒4wks后的皮肤组织中羟脯氨酸含量较PBS处理组明显增加,以上结果表明博莱霉素染毒后皮肤组织中发生了明显纤维化；(2)通过H&E染色后病理学观察结果显示,博莱霉素染毒组皮肤表皮层中临近基底膜上皮细胞和毛囊周围上皮细胞脱离基底膜的数量明显增加,并且染毒3wks组导致临近基底膜上皮细胞脱离基底膜的上皮细胞数量增加最为明显,而染毒4wks组的皮肤组织中,表皮层中临近基底膜上皮细胞脱离基底膜的数量较多；免疫荧光检测结果显示博莱霉素处理组皮肤组织中临近基底膜上皮细胞和毛囊周围上皮细胞中Vimentin蛋白表达较对照组也明显增强；进一步利用蛋白质免疫印迹和RT-PCR检测E-cadherin和Vimentin蛋白及基因在博莱霉素经皮注射皮肤组织中的表达,实验结果显示,随着染毒时间的延长皮肤组织中E-cadherin表达明显下调,而Vimentin表达明显上调,E-cadherin蛋白表达在染毒2wks,而Vimentin蛋白表达在染毒3wks时开始与PBS对照组之间差别具有统计学意义,以上结果表明博莱霉素诱导皮肤纤维化组织中上皮细胞发生了EMT现象；(3)通过对活性氧介导的脂质过氧化和蛋白质损伤及抗氧化酶活性检测发现,博莱霉素处理组皮肤组织匀浆中MDA和蛋白质羰基含量较PBS处理组明显增加,抗氧化剂NAC能明显抑制MDA和蛋白质羰基含量增加,经统计学检验分析,两者之间差别都具有统计学意义；对抗氧化酶活性检测发现博莱霉素处理组皮肤组织匀浆中SOD酶活力较PBS处理组明显增加,博莱霉素处理组CAT和GPX酶活力较PBS处理组变化不明显,但博莱霉素处理组GSR酶活力较PBS处理组明显下降,以上结果表明博莱霉素能明显诱导皮肤组织发生氧化应激；(4)通过蛋白质免疫印迹检测内质网应激特征性蛋白Bip在皮肤组织中的表达发现,博莱霉素染毒组皮肤组织中Bip表达水平从2W开始较PBS对照组明显增加,呈现时间-效应关系,并且经统计学检验分析,实验组较对照组差异都具有统计学意义。透射电子显微镜观察基底层上皮细胞内质网结构变化,观察结果显示基底层上皮细胞粗面内质网结构在博莱霉素染毒2wks即出现明显的扩张,在博莱霉素染毒3wks时扩张的粗面内质网数量明显增多。化学分子伴侣PBA能抑制内质网应激蛋白Bip和未折叠反应蛋白pIRE1α表达,并且PBA干预后能够能够抑制博莱霉素致皮肤组织中E-cadherin表达下调和Vimentin表达水平增高,以上结果表明博莱霉素能够诱导皮肤组织发生内质网应激,并且内质网应激参与调控上皮细胞发生EMT过程；(5)通过蛋白质免疫印迹检测pSmad2/3和pSrc蛋白质在博莱霉素经皮注射3wks后的皮肤组织中的表达情况及PBA的干预作用,结果显示博莱霉素能明显诱导pSmad2/3和pSrc蛋白质在皮肤组织中的表达,并且PBA能明显抑制博莱霉素诱导pS.mad2/3和pSrc蛋白质在皮肤组织中的表达,以上结果提示Smad2/3和Src介导的信号通路可能参与内质网应激诱导皮肤上皮细胞发生EMT；(6)利用抗氧化剂NAC来干预活性氧介导的生物学效应,结果显示NAC能够抑制Bip和pIRE1α在皮肤组织中的表达水平,抑制博莱霉素诱导E-cadherin表达下调和Vimentin表达上调,同时抑制皮肤组织纤维化,以上结果表明活性氧可能作为内质网应激诱导皮肤上皮细胞发生EMT和组织纤维化的上游信号分子。实验结论：在博莱霉素经皮注射诱导皮肤上皮细胞发生EMT及组织纤维化中,大量氧自由基可能通过诱导内质网应激,引发内质网未折叠蛋白反应中IRE1蛋白激活,IRE1可通过使Smad2/3激酶发生磷酸化从而激活其信号转导通路,进而下调上皮细胞标志物E-cadherin表达,上调间质细胞标志物Vimentin表达；或者可能通过激活Src激酶,继而激活其信号通路使E-cadherin介导的细胞间连接发生重构,或通过胞吞进入胞浆使其降解,最终使皮肤组织上皮细胞发生EMT。皮肤上皮细胞发生EMT后进一步增加了皮肤组织中肌成纤维细胞数量,导致细胞外基质成分尤其胶原纤维的增加,最终促使皮肤组织发生纤维化。
【作者】周承藩；
【导师】朱启星；
【作者基本信息】安徽医科大学，皮肤病与性病学，2013，博士
【关键词】硬皮病；上皮-间质转化；皮肤组织纤维化；氧化应激；内质网应激；博莱霉素；N-乙酰半胱氨酸；4-苯丁酸钠；动物模型；

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