CCN3通过Notch与BMP信号通路调控牙髓干细胞在牙再生中增殖与分化的研究

【摘要】研究背景：在牙发育过程中及牙成熟后，牙本质生成由终末成体成牙本质细胞分泌所形成。第一牙本质在牙冠和牙根发育成形过程中由成牙本质细胞分泌而成。第二牙本质生成于牙根发育成形，并且其分泌速度明显减慢。当牙发育完成，牙本质-牙髓复合体维持着牙内平稳状态以及自我保护机制，在牙损伤后形成保护牙髓的修复性牙本质层，即第三牙本质。成熟后的牙髓中含有干细胞，负责修复龋和机械磨损刺激给牙体牙髓造成的损伤及缺损。牙髓干细胞(Dentalpulpstemcells,DPSCs)，具有单克隆能力，高效自我更新活性及多向分化能力，已被公认为在牙组织修复过程中起着至关重要的作用。在牙受损后，DPSCs发生募集，移行，增殖并且向成牙本质细胞方向分化，最终在牙损伤处合成分泌出第三牙本质。修复性牙本质的形成由众多信号通路精密控制形成。近几年，牙本质形成的细胞、分子机制已成为牙再生治疗方法和临床研究探索的热点。牙在发育形成过程中，众多信号通路参与了上皮-间充质相互作用。Notch受体及配体在牙发育成形过程中表达于上皮和间充质组织。Notch信号通路已被证实在决定牙内皮细胞的命运及成牙本质分化方向方面起着至关重要的作用。Notch受体正常成体牙髓组织中表达较弱，而在牙体受损后其表达显著增强。在成体牙髓中，Notch1表达于干细胞部位，Notch2表达于成牙本质前体细胞及成牙本质细胞。骨形成蛋白(bonemorphogeneticprotein，BMPs)已被证实为诱导牙内皮-间充质相互作用中关键的信号通路。BMP2转录存在于牙乳头，并且随着成牙本质细胞的分化过程急剧增加。炎症作为一种牙损伤后的反应，与牙再生的过程密切相关。炎症产物在牙损伤部位与BMPs相互作用以促进牙损伤的修复与治愈。但是，对Notch与BMPs信号通路在牙修复再生过程中促进DPSCs增殖与分化的关键启动因子研究尚不清楚。NOV/CCN3(Nephroblastomaoverexpressed)最先被认为是人造血干细胞前体细胞启动因子。CCN3被敲除使原始前体细胞丧失功能。CCN3还被发现与组织愈合过程*本课题受国家自然科学基金项目（81170934；81300873）资助。密切相关。CCN3高度表达于皮肤伤口的肉芽组织，并且诱导纤维母细胞的一系列反应。因此CCN3被设想为有可能活跃地参与DPSCs功能的调节，并且在牙组织再生中起到重要的调控作用。方法：为研究第三牙本质在损伤条件下的反应情况，利用柱型金刚石钻头在无菌条件下制备成暴露的大鼠切牙缺损模型，并标记出牙髓中特异性表达CCN3的细胞群。接着利用慢病毒介导的CCN3过表达载体感染人DPSCs.通过细胞周期分析，CCK-8检测和PCNA表达检测研究了过表达CCN3对DPSCs增殖的影响。利用碱性磷酸酶检测，茜素红染色和细胞钙浓度定量分析检测过表达CCN3对人DPSCs成牙本质分化的影响。通过qRT-PCR和Western-blot检测Notch信号通路以及Runx2的表达。BMP2是诱导DPSCs成牙本质分化的重要因子，通过qRT-PCR和Western-blot检测了其表达。另外，将CCN3过表达DPSCs与对照组DPSCs以1：4混合在成牙本质分化诱导条件下共培养。通过碱性磷酸酶活性检测，茜素红染色和细胞钙浓度定量分析检测了共培养组细胞的成牙本质分化能力。CCN3过表达DPSCs与对照组DPSCs混合植入多孔PLGA支架进行体外成牙本质分化诱导2周后，将此细胞支架复合物移植到裸鼠皮下，进行vonkossa染色检测其矿化能力。最后，BMP2以3.5nM浓度做用DPSCs，通过qRT-PCR及Western-blot方法检测DPSCs中CCN3表达情况。结果：在牙修复再生过程中，CCN3呈现出短暂的高表达。过表达CCN3通过上调Notch信号通路促进人DPSCs增殖，并且抑制DPSCs成牙本质分化。过表达CCN3还上调DPSCs中BMP2表达以及分泌。过表达CCN3DPSCs通过上调BMP2分泌促使对照DPSCs以非自主方式上调成牙本质分化能力，并且裸鼠皮下移植实验证实其矿化能力增强。同时，BMP2对正常DPSCs中CCN3及Notch信号通路起抑制作用。结论：1.此研究表明，CCN3特异地表达于牙髓组织内干细胞并且在损伤后牙再生修复开始时期表达明显上调。2.过表达CCN3通过上调Notch信号通路增强了DPSCs增殖能力并且抑制其成牙本质分化能力。3.CCN3促进DPSCs中BMP2的表达及分泌，但被上调的Notch信号通路抑制了BMP2对DPSCs的促成牙本质分化作用。4.过表达CCN3促使DPSCs中BMP2分泌增强，此BMP2以非细胞自主方式促进DPSCs成牙本质分化。5.体内试验中，由过表达CCN3的DPSCs和正常DPSCs以1：4比例混合共培养系统里，CCN3对促进牙再生起到至关重要的作用。
【作者】王雪飞；
【导师】谭颖徽；
【作者基本信息】第三军医大学，外科学，2014，博士
【关键词】牙再生；肾母细胞瘤过表达因子(NOV/CCN3)；牙髓干细胞；(DPSCs)；Notch信号通路；骨形成蛋白-2；(BMP-2)；聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)支架；

【参考文献】
[1]龚丽润.机构投资者持股与我国上市公司违规行为的实证研究[D].新疆财经大学,会计学,2013,硕士.
[2]刘英杰,任眷西.一种微机配料混合自动控制系统[J].自动化学报,1991,04:498-502.
[3]刘繁.中国上市公司内部控制信息披露影响因素研究[D].广东外语外贸大学,会计学,2013,硕士.
[4]沈寨.裁判合理性研究[D].山东大学,法学理论,2014,博士.
[5]万书鹏,雷宝龙,翟明玉.调度与变电站一体化系统链路状态监测与TCP通信方案[J].电力系统自动化,2014,01:92-96.
[6]梁远升,王钢,李海锋.双端不同步线路参数自适应时频域故障测距算法[J].电力系统自动化,2009,04:62-66.
[7]吕文俐.职业高中计算机专业学生英语学习动机实证研究[D].宁波大学,学科教学（专业学位）,2013,硕士.
[8]刘畅.旅游文化的传播战略研究[D].重庆工商大学,传播学,2014,硕士.
[9]田锐花.多聚磷酸盐对牛肉加工特性的影响研究[D].南京农业大学,食品工程,2012,硕士.
[10]曹进茂,唐伯钢,王世亮,张再范.熔炼型低氢高韧性焊剂的研究[J].焊接学报.1989(01)
[11]杨杰.锂离子电池电极材料V_2O_5的制备与电化学性能研究[D].湘潭大学,2012.
[12]陈鹏.电力机车的空转识别及防空转研究[D].西南交通大学,电气工程,2013,硕士.
[13]井彦林,仵彦卿,崔中兴.关于环境岩土工程研究方法的探讨[J].煤炭工程,2004,02:51-54.
[14]张鸿宾,孙广煜.Tabu搜索在特征选择中的应用[J].自动化学报,1999,04:29-38.
[15]赵静.精益生产方式在S公司应用研究[D].吉林大学,工业工程,2014,硕士.
[16]谭锦彪.遍历平面内Partial-Order线段集的ESP求解算法研究[D].大连海事大学,软件工程,2013,硕士.
[17]关羽.悬挂在十字架上的圣者[D].南京师范大学,电影学,2012,硕士.
[18]杨慧.行政垄断及反行政垄断立法研究[D].苏州大学,法学,2003,硕士.
[19]王光慧.基于DELMIA的减速箱虚拟装配技术与算法研究[D].兰州理工大学,机械制造及其自动化,2013,硕士.
[20]尹鹏英.天藤降压汤治疗原发性高血压的临床研究[D].河北医科大学,中西医结合临床,2013,硕士.
[21]黄琳.河岸带植物对环境胁迫的响应—多物种比较研究[D].北京林业大学,自然保护区学,2013,硕士.
[22]张爽.庞胜斌防卫过当案研究[D].黑龙江大学,法律,2013,硕士.
[23]苗地.由醋酸锰/氯化钴体系联合催化的新型氧化反应的底物拓展及其在吡咯衍生物一锅法合成方面的应用[D].华东理工大学,药学,2014,硕士.
[24]杨家刚.先秦神主制度研究[D].西北大学,中国史,2014,硕士.
[25]诸思源.皮亚杰活动理论研究述评[D].湖南师范大学,基础心理学,2013,硕士.
[26]谢乐乐.浙江制造业产能过剩的测度、成因及对策[D].浙江工商大学,产业经济学,2012,硕士.
[27]张宇.矮塔斜拉桥0号块局部分析[D].西南交通大学,建筑与土木工程,2013,硕士.
[28]张晓峰.国有投资控股公司组织结构设计[D].西安建筑科技大学,管理科学与工程,2004,硕士.
[29]王家春.基于SAMA5D35的机车CCU主板设计与开发[D].西南交通大学,电气工程,2014,硕士.
[30]司怡.中国人口城市化水平及未来发展趋势研究[D].吉林大学,人口学,2004,硕士.
[31]赵卫国.文化艺术品交易所运营模式研究[D].山东大学,项目管理（专业学位）,2012,硕士.
[32]吴彬.考虑热载荷的散热器进水室应力分析[D].重庆大学,车辆工程,2014,硕士.
[33]晋龙兴,李银红,石东源,杨增力,王友怀.计及空间分布特性的最小断点集优化求取方法[J].电力系统自动化,2013,07:60-65.
[34]吴世琦.民事再审制度的功能缺陷及完善[D].安徽大学,法律,2003,硕士.
[35]董雷刚.民族地区与东南沿海地区上市公司并购绩效比较研究[D].中南民族大学,企业管理,2013,硕士.
[36]冯向前,魏翠萍,胡钢,李宗植.区间数判断矩阵的一致性研究[J].控制与决策,2008,02:182-186.
[37]拓中华,王连生,张文仁,韩鑫,刘明光,吕继光,耿庆凯,林凌,高妍,钟鋐州,刘铁.新型无线遥控开关站及其应用[J].电气化铁道,2014,04:46-50.
[38]牛雪丽.我国文化产业的全要素生产率研究[D].西北大学,技术经济及管理,2013,硕士.
[39]唐敬儒.团体社会工作模式下大学生的道德社会化研究[D].吉林农业大学,社会工作（专业学位）,2014,硕士.
[40]唐元元.联合IL-5可溶性受体与IL-4突变体对哮喘小鼠气道高反应性及IgE、IFN-γ水平的影响[D].第四军医大学,内科学（专业学位）,2014,硕士.
[41]殷志良,刘万顺,杨奇逊,秦应力.基于IEC61850的通用变电站事件模型[J].电力系统自动化,2005,19:45-50.
[42]丁大星.化学品水域泄漏三维浓度场研究[D].大连海事大学,船舶与海洋工程,2014,硕士.
[43]胡威.深圳电视台DSNG车传输系统设计与实施[D].河北工程大学,计算机技术,2012,硕士.
[44]袁万勇.申银万国期货公司内部控制体系研究[D].石家庄经济学院,工商管理,2013,硕士.
[45]严怀成.网络控制系统的分析与综合[D].华中科技大学,2007.
[46]王婧.中文作为澳大利亚维州高考科目的考察与分析[D].北京外国语大学,汉语国际教育,2014,硕士.
[47]杨建俊.基于ANSYS的大型矩形换热器的结构优化分析[D].郑州大学,动力工程（专业学位）,2013,硕士.
[48]窦智.普瑞巴林与吗啡联合用于癌性神经病理性疼痛治疗的效果评价[D].广西医科大学,麻醉学（专业学位）,2013,硕士.
[49]付媛媛.DNA计算编码设计优化方法研究[D].湖南大学,软件工程,2011,硕士.
[50]秦琴.人源性抗乙型肝炎表面抗原（抗HBs）噬菌体单链抗体库的构建[D].山西医科大学,生物化学与分子生物学,2003,硕士.