硫酸庆大霉素脂质体复合多孔β-TCP支架的制备及其体外抗生物膜活性的实验研究

【摘要】骨髓炎是骨关节外科手术后的一种常见的感染性并发症,严重的可能导致截肢甚至患者死亡。骨髓炎由于涉及到持续性的细菌感染,因此治疗极为困难,往往需要经过多次外科手术,并联合局部或全身的抗生素治疗。骨髓炎的常见致病菌为金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性菌。由于骨骼存在特殊的内部环境,抗生素很难在其内部达到有效的抑菌浓度,而且在特定的情况下,细菌可以形成这对细菌具有很强的保护作用的生物膜,且耐药信息可以轻易地传递并在细菌之间交换。其结果是,骨髓炎中的细菌与浮游细菌相比较总是具有很强的耐药性。因此,寻求有效的治疗骨髓炎的新型给药系统亟待解决。β-磷酸三钙(β-TCP)作为一种骨替代材料,具有良好的生物相容性,目前被作为可降解支架材料广泛使用。此外,β-TCP还具有诱导骨形成的能力。由于具有生物可降解性,并含有多孔,聚磷酸钙支架可以作为抗生素载体用于治疗细菌相关的骨髓炎。它们可能会使抗菌药物在局部高效释放,并避免被清除。此外,在它生物降解的同时引起的抗生素二次释放,使它负载的抗生素与不可生物降解的载体相比,可能会会更加有效。脂质体是一种具有生物相容性和生物可降解两种特性的药物载体,可以持续而有针对性的递送包括抗生素等各种药物。它可以修饰药物的生物药理特性,如改变药物的吸收及分布。脂质体已被证明是对提高抗生素的功效并降低其不良反应的有效途径。此外,已有研究表明脂质体在治疗细菌生物膜相关性感染具有一定优势。目前脂质体在针对应用抗生素治疗细菌生物膜相关感染中被广泛研究和应用。硫酸庆大霉素(GS)是一种氨基糖苷类抗生素,并且是一种治疗由革兰氏阳性菌引起的骨髓炎的有效药物。氨基糖苷类抗生素的疗效取决于它们是否在治疗部位达到其有效的抑菌浓度,而高剂量的氨基糖苷类药物又会带来药物毒性反应的风险。因此,采用脂质体包被GS是一个有希望的抗菌策略,可由此在感染部位增加抗生素的浓度、延长药物释放时间,并且可以有效地降低药物的毒性反应。基于以上分析,本研究拟制备负载GS的脂质体,将其与β-TCP支架(LCS)复合,研究其在体外的释药特性,并对其在体外的抑制生物膜活性进行研究,以期为临床治疗顽固性骨髓炎提供实验基础。研究分为三个部分进行：(1)硫酸庆大霉素脂质体的制备及其质量评价。(2)GS脂质体复合多孔β-TCP支架(LCS)的制备及体外释药研究。(3)GS脂质体复合多孔β-TCP支架体外评估抗生物膜活性。主要研究方法：1.GS脂质体的制备及包封率测定；将DPPC和胆固醇以3：1的摩尔比混合后溶解在甲醇和氯仿(体积比1：4)组成的混合溶剂。将脂溶液置于圆底烧瓶中,旋转蒸发器在40℃、减压条件下干燥以形成干燥的脂质膜；脂膜在真空中进行12小时干燥；此后,脂质膜与2%(重量/积)的GS溶液在55℃下磁力搅拌形成均匀的悬浮液。将悬浮液用探针型超声波仪,在不同的超声处理功率和时间下均化和减小粒径；然后在60000g,4℃下进行离心2h,分离未包封的GS；将沉淀物重新悬浮在适量去离子水；脂质体的包封率(EE)的计算通过使用AXSYM系统测定在超速离心后的上清液中的未包封GS浓度,并与添加到该制剂中的初始GS量比较。制备GS脂质体的粒径用Nano-ZSzeta粒度仪在25℃下条件分三组进行分析。2.GS脂质体复合β-TCP支架(LCS)的制备医疗级β-TCP支架(0.5毫米颗粒)称重后浸入GS脂质体样品中,在浴式超声仪超声处理20min,然后将压力降至0.09兆帕后继续处理20分钟,以使脂质体充分渗入多孔支架。随后,将样品转移至玻璃瓶并冷冻干燥。将颗粒放入1%的TritonX-100溶液中研磨,然后超声处理10分钟以完全释放脂质体GS。将所得悬浮液在4000rpm离心10分钟,并通过AXSYM系统对上清液中的GS含量进行测定。3.扫瞄电镜观察支架形态将冻干的支架截断,然后连接到到金属底座并在真空下镀金。扫描电子显微镜进行形态学观察。4.体外释放研究将0.2克颗粒加入含有1.0毫升PBS溶液(pH7.4)的EP管中,在37℃,30转条件下振荡水浴。定时取出释放介质,并加入等体积新鲜培养基。取出的培养基在60000g和4℃下进行超速离心2小时。上清液中的GS含量通过AXSYM系统进行分析。沉淀物中加入1.0ml1%的TritonX-100溶液,超声处理10分钟将脂质体裂解后对GS含量进行分析。5.细菌生物膜的准备将金黄色葡萄球菌接种到血琼脂平板。37℃孵育过夜,然后将细菌从固体琼脂平板转移至含有营养肉汤和酵母提取物的离心管中,离心管在恒温振荡器在37℃过夜,然后将试管以2000rpm离心10分钟,除去上清。将沉淀溶于20mL无菌PBS。上述过程重复三次。细菌悬浮液用PBS稀释至OD值为5.5(吸光值为550nm处)。然后将细菌悬浮液以每孔200μL接种到96孔平底微量滴定板并在室温下孵育18小时。在使用前除去上清液并将孔用PBS洗涤三次。6.脂质体联合β-TCP支架抗生物膜活性评价体外释放一定间隔如前所述,收集释放介质,超速离心,再悬浮,以形成适当的浓度,形成生物膜的孔中每孔加入200μL,时间1小时,然后除去。对照组用GS水溶液和空白PBS分别在相同的总体药物浓度下处理。1h后将孔用PBS洗涤三次以除去游离的药物和细菌,然后加入培养基至550nm处的OD值为0.1。然后每隔30分钟测定一次在630nm处的OD值,总时间为24小时,记录OD值达到0.5的时间。7.激光共聚焦显微镜观察细菌生物膜的形成采用6孔板培养细菌,在盖玻片上形成生物膜,24小时后分别用GS脂质体复合β-TCP支架、游离庆大霉素及PBS干预,培养48小时后取出玻片,采用FITC-ConA及PI染色,激光共聚焦显微镜(CLSM)下观察生物膜形成的情况。8.统计学处理实验是每个样品一式三份,数据表示为平均值±标准差(SD)。统计分析采用单因素方差分析(ANOVA)分析,用统计软件SPSS11.0进行分析。p值<0.05为有显著性差异。主要结果1.GS脂质体的特性制备了从100nm到5μm的粒径的脂质体,与β-TCP支架材料复合。不同超声处理条件下可以得到不同粒径的脂质体。当超声处理功率升高或超声处理时间延长,脂质体的平均粒径缩小。脂质体的包封率随粒径的降低而降低(LCS1～5)。2.LCS的特性硫酸庆大霉素脂质体复合前后的支架扫描电镜显示在复合前,β-TCP支架有一个相对平滑的表面,其微孔直径约100微米；在与硫酸庆大霉素脂质体复合后,可见脂质体颗粒被吸附于支架的表面上。复合于β-TCP支架材料的脂质体具有不同的粒径。该GS脂质体配方GL1～5对应于不同粒径分别用LCS1～5表示。GS含量在LCS3的情况下达到最高水平,约7.05毫克/克,在LCS1的情况下为GS最低水平,约4.95毫克/克。LCS3和LCS2中脂质体的含量最高,分别是162.07毫克/克和160.49毫克/克,两组之间无显著性差异(p>0.1)；当脂质体粒径从5μm减小到800nm,该脂质体复合效率提高.3.在体外GS从LCS释放硫酸庆大霉素主要以脂质体的形式从β-TCP支架中释放。24小时之内,游离的硫酸庆大霉素累积释放只有约5%。对样品的释放结果分别进行一级释药方程、Higuchi平面扩散模式方程以及Ritger-Peppas方程模拟,表明在初始的第1小时不同制剂的释放曲线是类似的,都是一个快速释放模式。随后释放减速,各组间出出现差异,释放常数k随着脂质体的粒径的增加呈下降趋势。此外,释放常数k的趋势呈现多元化,在0.5～2小时的间隔,5种不同粒径的脂质体复合的LCS支架的释放常数k比较相似,其中LCS2和3超过0.50的限制值。4.抗生物膜活性评价采用FITC-ConA标记生物膜基质中的多糖,用碘化丙啶(PI)标记生物膜中的细菌,借助激光扫描共聚焦显微镜观察生物膜的水平断层图像。结果显示与对照组相比,硫酸庆大霉素脂质体复合的支架能够显著抑制生物膜结构的形成并能有效杀死其内定植的细菌。为了模拟从LCS中的脂质体释放GS的不同阶段,抗生物膜活性研究中将GS的含量范围设定为从2.5μg/mL到800μg/mL的不同浓度,并与相同浓度单纯GS组相比较。结果显示即使是在最低浓度,与对照组相比,LCS组仍然显示出较好的抗生物膜活性(p<0.01)。结论我们制备的硫酸庆大霉素脂质体通过不同的超声处理得到了不同粒度的GS脂质体,并将其成功的复合于多孔β-TCP支架中。扫描电镜观察确认其复杂的结构和脂质体的结合率足够高,可以提供药物的有效递送。在起始阶段,从LCS中的药物是以脂质体的形式释放,然后再释道出游离的GS,这种释放方式是用于治疗和预防术后骨髓炎的一种理想释放模式；在抗细菌生物膜的研究中,与游离的GS相比,GSLCS显示出显著的抗生物膜活性,同时,其抗生膜活性也与脂质体的粒径相关。我们的研究表明,硫酸庆大霉素脂质体复合的β-TCP支架可能是一种用于治疗骨髓炎的有效策略。但其在体内的药物释放及效果评价有待于进一步研究。
【作者】朱崇涛；
【导师】徐永清；
【作者基本信息】第三军医大学，外科学（专业学位），2014，博士
【关键词】骨髓炎；金黄色葡萄球菌；β-磷酸三钙支架；脂质体；脂质体复合支架；生物膜；药物控制释放；

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