WIG-1在食管癌组织及人源性食管鳞癌细胞系EC109中的表达及其临床意义研究

【摘要】背景食管癌是常见的恶性肿瘤之一，近些年来发病率有所上升，与其他恶性肿瘤相比其预后较差，纠其主要原因就是门部分食管癌在早期就己经发生远处转移和淋巴转移。近年来，基因治疗成为肿瘤治疗方面的一大热点，有可能成为未来治疗肿瘤的一个有效手段，对于食管癌来说，基因层次的研究较其他肿瘤来说还比较少，因此寻找一个在食管癌发生、移转中能够起到关键作用的分子就显得比较迫切[1]。WIG-1（wild-typep53-inducedgene1，野生型p53诱导基因1）是一种由p53基因诱导表达的锌指蛋白，与双链RNA结合后，能够发挥抑制细胞生长的作用，因此有可能是食管癌的一个潜在的基因治疗靶点。本研究通过分析WIG-1在不同食管癌组织的表水平达差异，得到其与食管癌患者的预后可能存在的关系；并通过构建WIG-1不同表达水平的人源性食管鳞癌细胞系EC109，来进一步探讨WIG-1对食管鳞癌细胞主要的生物学行为方面的影响以及可能的作用机制，并进一步筛选出WIG-1可能的作用分子，可望为食管癌的基因治疗方面提供一定的临床应用价值。目的制备WIG-1单克隆抗体，为进一步的研究工作打下坚实的基础。了解WIG-1不同的表达水平与食管癌患者临床表现之间的关系；构建WIG-1高表达与低表达的人源性食管鳞癌细胞系EC109，从而可以进一步研究WIG-1基因对于EC109细胞的生长、凋亡以及侵袭等生物学行为的影响；探讨WIG-1对EC109细胞的化疗药物敏感性、化疗药物的耐药性以及对细胞损伤、修复等能力的影响，并提出其可能的分子机制；通过WIG-1对基因表达谱的影响来筛选出其可能的作用分子。方法应用杂交瘤技术制WIG-1单克隆抗体；应用RT-PCR和免疫组化技术检测食管癌组织及其对应近癌、远癌组织中WIG-1基因的表达；应用脂质体转染法构建了WIG-1基因高表达与低表达的人源性食管鳞癌细胞系EC109，并用RT-PCR和Westernblot技术进行鉴定；应用MTT实验绘制WIG-1基因不同表达水平的EC109细胞的生长曲线；应用MTT实验、平板克隆实验、流式细胞仪技术以及DNA断裂实验检测WIG-1基因不同表达水平的EC109细胞的细胞周期和细胞凋亡的变化；应用Transwell侵袭小室实验和细胞损伤刮擦试验来检测WIG-1基因不同表达水平对人源性食管鳞癌细胞系EC109侵袭活性的影响；应用MTT实验进行体外药物敏感性分析，计算细胞对药物的IC50值；应用WesternBlot检测WIG-1基因的不同表达水平对部分耐药分子表达水平的影响；应用单细胞凝胶电泳技术检测WIG-1基因不同表达水平对于由紫外线照射造成的不同的DNA损伤情况及修复能力；10、应用基因芯片技术检测WIG-1基因对EC109细胞基因表达谱的影响；11、就用酵母双杂交技术筛选出WIG-1基因可能的作用分子。结果1、成功制备了WIG-1单克隆抗体，并通过WesternBlot及免疫组化实验证实；2、WIG-1基因在食管癌肿瘤的不同部位的标本中存在差异性表达，食管癌组织中WIG-1基因的表达水平明显低于近癌及远癌组织，而近癌组织则显著低于远癌组织（p<0.05）；成功构建了WIG-1基因高表达及低表达的人源性食管鳞癌细胞株EC109，并通过半定量RT-PCR及Westernblot实验证实；MTT法、平板克隆形成实验、DNA断裂实验、流式细胞仪技术、Transwell侵袭小室实验以及细胞损伤刮擦实验等的结果表示，WIG-1基因的高表达可以抑制EC109细胞的增殖，促进其凋亡，并能够显著降低人源性食管鳞癌细胞系EC109的侵袭、移动能力；5、WIG-1基因的高表达能够显著增强EC109细胞对5-氟尿嘧啶（5-Fu）、顺铂（CDDP）、阿霉素（ADR）等化疗药物的敏感性，对长春新碱（VCR）的敏感性，则无明显影响，WIG-1基因可能通过抑制ERCC1及P-gp的表达进而提高EC109细胞对于化疗药物的敏感性，降低EC109细胞对化疗药物的耐受性；6、WIG-1基因的高表达能够减少紫外线照射对EC109细胞的DNA损伤效应，并显著增强EC109细胞的DNA修复能力；7、基因芯片检测结果表明，上调WIG-1基因的表达水平可以影响419种基因的表达，而上调WIG-1基因的表达水平可能影响301种基因的表达；8、酵母双杂交实验结果筛选出WIG-1基因的可能作用分子为：ILF3（NM017620），UTP14A（NM006649），Sox3（NM005634）。结论制备了WIG-1单克隆抗体，为本实验研究以及进一步的深入研究奠定了一个良好的基础。并构建了WIG-1基因高表达及低表达的人源性食管鳞癌细胞株EC109。WIG-1基因不仅在食管癌组织细胞中有表达，且在正常的组织细胞中亦有表达，其食管癌组织中的表达水平显著低于对应近癌及远癌组织；WIG-1基因的高表达可以抑制EC109细胞的增殖，促进其凋亡，而WIG-1基因的低表达可以促进EC109细胞增殖，抑制其凋亡；WIG-1表达水平增高可以抑制ERCC1和P-gp的表达，进而提高EC109细胞对于化疗药物的敏感性，而WIG-1表达水平下降时，结果恰恰恰相反；WIG-1基因高表达可以增强EC109细胞的紫外线耐受性及DNA修复能力；上调或下调WIG-1基因表达水平可以影响多种基因的表达，希望在进一步的研究中可以探寻到WIG-1基因，作为一个己知抑癌基因的一个调控点，其具体的作用机制，从而为食管癌的诊断与治疗方案提供更多的选择。
【作者】邹瀛波；
【导师】蒋耀光；
【作者基本信息】第三军医大学，外科学，2014，博士
【关键词】WIG-1；食管癌；EC109细胞；稳定转染；细胞生长与凋亡；DNA损伤修复；

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