MiRNA与功能基因转录组联合分析筛选延边黄牛肉质性状候选基因

【摘要】本研究以延边黄牛为研究对象,运用牛全基因组芯片和miRNA芯片分别分析了阉牛和公牛背最长肌组织的差异表达基因和差异表达miRNA,采用qRT-PCR技术对芯片结果进行了验证。利用miRanda程序对差异表达miRNA进行靶基因预测,并对差异表达基因和差异表达miRNA进行关联分析,构建了miRNA-基因作用网络,对差异靶基因进行GO功能注释和Pathway分析,从而筛选出了影响肉质性状的功能基因和调控通路,并初步阐明miRNA调控阉牛肉质性状形成的分子机制,为延边黄牛肉质性状的遗传机理和在肉牛生产中进行分子育种提供了理论基础。本研究主要结果如下：(1)选取延边黄牛公牛和阉牛各10头进行肉质性状测定,结果表明：阉牛肉含水量、粗脂肪含量和大理石花纹等级显著高于公牛(p<0.05)；阉牛的月桂酸、豆蔻酸、豆蔻油酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、总脂肪酸、饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸、多不饱和脂肪酸含量及背膘厚极显著高于公牛(p<0.01)。在脂肪酸组成比例中,阉牛肉的硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、多不饱和脂肪酸所占比例极显著低于公牛(p<0.01),月桂酸、豆蔻酸、豆蔻油酸、棕榈酸、棕榈油酸、油酸和单不饱和脂肪酸所占比例极显著高于公牛(p<0.01),饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸所占比例阉牛与公牛差异不显著(p>0.05)。阉牛肉的粗蛋白含量和眼肌面积显著低于公牛(p<0.05)；阉牛肉的剪切力值极显著低于公牛(p<0.01)。(2)随机选取延边黄牛公牛和阉牛各3头,利用Affymetrix牛全基因组芯片对其背最长肌组织进行差异表达分析。结果表明：在公牛和阉牛之间共有85个基因存在差异表达,其中30个基因在阉牛中表达上调,55个基因在阉牛中表达下调。GO分析结果表明：32个基因涉及氧和活性氧代谢等生物学过程；22个基因与细胞顶端组成、Ⅱ型主要组织相容性复合体蛋白复合物组成等细胞组成有关；39个基因与脂质结合、维生素结合等分子功能有关。Pathway分析结果表明：27个差异基因参与57个KEGG通路。(3)公牛和阉牛背最长肌组织miRNA芯片检测结果表明：共有3737个miRNA在公牛和阉牛背最长肌中共同表达,其中246个为牛上已知的miRNA,另外3491个为未知miRNA。对已知的miRNA差异表达分析发现,有32个miRNA在公牛和阉牛中存在差异表达,其中25个在阉牛中上调表达、7个下调表达。根据miRNA与靶mRNA间的负调控关系,这与阉割后差异表达基因的表达趋势一致,表明这些miRNA可能与阉牛和公牛肉质差异有关。并预测到了差异miRNA的7181个潜在靶基因。(4)选择差异表达miRNA中的bta-miR-2407、bta-miR-122和bta-miR-15a三个miRNA和差异表达基因中的CRLF3、ABAT、USP15、SCN4B、ANGPTL4、ROCK2、DGAT2和FABP4八个基因,对芯片结果进行了qRT-PCR验证,结果表明：所验证的miRNA和基因在公牛和阉牛间的差异倍数均达到显著水平(p<0.05),其中FABP4、ANGPTL4和SCN4B三个基因达到极显著水平(p<0.01),与miRNA芯片和全基因组芯片结果相符,表明芯片试验结果可靠。(5)MiRNA芯片与全基因组芯片结果的关联分析表明：延边黄牛公牛和阉牛背最长肌组织32个差异表达miRNA中有26个关联到21个差异靶基因,其中20个miRNA表达上调、6个：niRNA表达下调。20个表达上调的miRNA调控12个靶基因表达下调,6个表达下调的miRNA调控9个靶基因表达上调。(6)对21个差异靶基因进行GO和Pathway分析。GO分析结果显示：阉牛中下调的差异靶基因分属于81个生物学过程、35个细胞组成、33个分子功能。阉牛中上调的差异靶基因分属77个生物学过程、33个细胞组成、44个分子功能。Pathway分析结果显示,下调差异靶基因属10个Pathway分类,上调差异靶基因属12个Pathway分类。(7)通过关联分析并结合文献报道,初步认为延边黄牛公牛阉割后,bta-miR-2455、bta-miR-214、bta-miR-216b、bta-miR-671在阉牛背最长肌中表达下调,其调控基因DGAT2、ANGPTL4、ROCK2、PLIN5表达量增加；bta-miR-122、bta-miR-1271、bta-miR-16a、bta-miR-200c、bta-miR-16b、bta-miR-29b、bta-miR-221、bta-miR-15a、bta-miR-199c、bta-miR-26b、bta-miR-31、bta-miR-224、bta-miR-27a-3p在阉牛背最长肌中表达量上调,抑制了其调控基因ABAT、ATP6V0D2、USP15、DDIT4、FPGT的表达。这些基因参与肌肉组织糖、脂肪、蛋白质和能量代谢,主要涉及WNT信号通路,PPAR信号通路,甘油酯代谢,丁酸代谢,缬氨酸、.亮氨酸和异亮氨酸降解,丙氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸代谢,mTOR信号通路,p-丙氨酸代谢等,表明这些miRNA与延边黄牛肉质性状密切相关。包括DGAT2、ANGPTL4、ROCK2、PLIN5、ABAT、ATP6V0D2、USP15、DDIT4、FPGT等在内的9个基因可能是影响延边黄牛肉质性状的重要候选基因。
【作者】夏广军；
【导师】严昌国；金鑫；
【作者基本信息】延边大学，动物遗传育种与繁殖，2014，博士
【关键词】延边黄牛；肉质；miRNA；mRNA；芯片；差异表达；

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