五种苔类植物的化学成分及其抗肿瘤活性研究

【摘要】苔藓植物在植物进化过程中介于藻类植物与蕨类植物之间,是一类代表着从水生到陆生过渡的高等植物类群,从形态学上可以分为苔纲、藓纲和角苔纲。在民间,苔藓植物被广泛用于治疗外伤、烧伤、炎症、肺结核、肝脏疾病、惊厥和水肿等症。大部分苔藓植物均不被各种昆虫或其他动物所采食,也不会被真菌、细菌或病毒所感染。近年来,国内外对苔类植物研究较多,已从中分离获得了大量结构新颖的萜类和芳香类化合物,其中许多具有良好的生物活性。本文对中国的五种苔类植物,包括采自广西的圆叶异萼苔、齿边广萼苔、延叶叶苔、透明叶苔和采自贵州的双齿异萼苔的化学成分进行了系统研究,采用MCI柱层析、硅胶柱层析、SephadexLH-20柱层析、C1s反相硅胶柱层析以及HPLC等分离手段共分离了78个次级代谢产物。通过核磁共振、质谱、圆二色谱和X射线单晶衍射等方法确定了化合物的结构,包括60个二萜、4个三萜、6个甾体以及8个其他类化合物,其中新化合物41个。本文对圆叶异萼苔和延叶叶苔的成分研究尚属首次。从圆叶异萼苔Heteroscyphustener)中分离并鉴定了8个化合物,包括5个ent-半日花烷型(1-5)和3个壳梭孢烷型(6-8)二萜,其中1-4为新化合物。测定了化合物1-8对9种细胞株(PC3,DU145,K562,A549,NCI-H292,NCI-H1299,NCI-H446,HBE,RWPE1)的细胞毒性,结果显示化合物3和5有中等偏弱的活性。对化合物5在前列腺癌PC3和DU145细胞株中的细胞毒机制进行了进一步的研究,发现其通过诱导细胞内ROS水平的升高,引起DNA氧化损伤,进而诱导细胞周期阻滞在G0/G1期,从而诱发细胞凋亡。从双齿异萼苔(H.coalitus)中分离并鉴定了16个化合物,骨架类型比较多,包括1个具有新颖骨架的香豆素类衍生物(9)、1个视黄烷型二萜(10)以及1个单萜查尔酮衍生物(11)等,其中10为首次从苔藓植物中分得的视黄烷型二萜类化合物。测定了化合物9-12对3株肿瘤细胞(PC3,DU145,HepG-2)的细胞毒活性,它们均表现出中等偏弱的活性。从化学分类学角度对异萼苔属植物进行了分析,发现所研究的这两种同属植物在化学上完全不同,而圆叶异萼苔有可能属于毛耳苔亚目。从齿边广萼苔(Chandonanthushirtellus)中分离并鉴定了7个西松烷型二萜(25-31)、1个壳梭孢烷型二萜(6)以及3个简单芳香化合物(32-34),其中25-29为新化合物。筛选了化合物25-31对6种肿瘤细胞株(PC3,A549,NCI-H292,NCI-H1299,A172,PC12)的细胞毒性,它们大都表现出较弱的活性。我们得到的西松烷型二萜可以作为该属植物的化学标记物。从延叶叶苔(Jungermanniafauriana)中分离并鉴定了24个对映-贝壳杉烷型二萜化合物(35-58),其中35-54为新化合物。从透明叶苔(J.hyalina)中得到了23个相同骨架的化合物(56-78),其中59-70为新化合物。化学分类学分析表明这两种植物都富含对映-贝壳杉烷二萜化合物,这类化合物在叶苔属中较为常见,可以作为化学标记物。含有相同的3个化合物说明这两种植物可能有着一定的亲缘关系。另外,以甜菊苷为原料合成了3个相同类型的化合物80-82。系统筛选了所得化合物对24株人类细胞的细胞毒活性。发现该类化合物毒性比较大,对细胞种类的选择性差。系统的构效关系分析表明α,β不饱和酮的结构是活性的必需基团,18或19位的甲基羟基化后会降低活性,羧基化使活性进一步降低,但是羧基成酯或成酰胺会使活性大大增强。通过一种巯基荧光探针染色发现该类化合物进入细胞后显著降低了荧光强度,且没有明显的分布特点,这可能是其作用选择性差和毒性大的主要原因。化合物82具有碱性基团,对其作用的细胞巯基探针的荧光定量发现它进入细胞后只是部分降低了荧光强度。通过对溶酶体的染色发现,82作用于溶酶体,2h后就可以引起溶酶体明显的肿胀。这说明碱性基团修饰可能会使其选择性分布于溶酶体,从而改变了该类化合物在细胞内的分布和作用方式。对化合物的作用机制研究中,发现化合物81可以引起ROS升高,还原剂NAC可以同时逆转ROS升高和细胞毒,但是VC为还原剂时虽能逆转升高的ROS,但是不能逆转细胞死亡。通过HPLC-MS/MS的方法研究发现,当将化合物81加入到含有NAC的培养基中后几乎检测不到化合物原型的存在,但却同时检测到了加成产物81-NAC。这说明NAC之所以会逆转细胞毒是因为与化合物发生反应,使之失去药效集团。所以很多学者在研究该类化合物时用NAC作为还原剂来证明ROS的作用是不准确的,ROS也可能不是引起细胞死亡的主要因素。本论文对中国的五种苔类植物的系统化学成分研究得到了41个新结构化合物。抗肿瘤活性筛选发现了具有中等活性的半日花烷型二萜,并且报道了其中的化合物5通过ROS途径引起细胞周期G0/G1阻滞和凋亡,以及一批具有较好活性的对映-贝壳杉烷型二萜,并总结了其构效关系。首次采用一种小分子荧光探针来检测化合物在细胞内的分布,并针对分布特点特异性改造了化合物结构。首次采用液质联用方法证明了还原剂NAC与对映-贝壳杉烷型二萜类化合物发生反应而使其毒性消失。根据系统的化学成分研究总结了所研究植物的化学分类学规律。
【作者】林兆民；
【导师】娄红祥；
【作者基本信息】山东大学，天然药物化学，2014，博士
【关键词】苔类植物；圆叶异萼苔；双齿异萼苔；齿边广萼苔；延叶叶苔；透明叶苔；二萜；抗肿瘤；化学分类学；溶酶体；ROS；

【参考文献】
[1]吕文静.锦州电信CDMA无线网络优化技术研究[D].吉林大学,电子与通信工程,2014,硕士.
[2]梁苗.腹腔镜卵巢成熟畸胎瘤剔除术两种止血方法对年轻患者卵巢储备功能的影响[D].遵义医学院,妇产科学（专业学位）,2013,硕士.
[3]刘晓慧.基于语料库的中外学术语篇标记性名词使用对比分析[D].华中科技大学,学科教学,2013,硕士.
[4]高泽生.铝钛硼生产中形成的副产品——氟铝酸钾的有效利用[J].轻金属.1992(06)
[5]范明宽.深圳市社区卫生服务现状研究[D].华中科技大学,公共卫生,2013,硕士.
[6]杨小巍.牡丹江地区乡镇企业节能减排发展问题研究[D].吉林大学,农业推广,2012,硕士.
[7]刘海涛.刚柔性长短桩复合地基工程性状分析[D].浙江大学,岩土工程,2004,硕士.
[8]牛娜.QFII在华投资策略的经验考察[D].暨南大学,国际商务（专业学位）,2013,硕士.
[9]王培.八仙花切花不同商品肥料应用及保鲜技术研究[D].宁夏大学,园艺（专业学位）,2014,硕士.
[10]彭婷婷.中晚明布衣诗人研究[D].厦门大学,中国古代文学,2014,硕士.
[11]沈重.捆绑火箭CAD/CAE一体化设计技术研究[D].国防科学技术大学,航天工程,2013,硕士.
[12]杨艳.基于贵金属掺杂的碳纳米材料的电化学研究及其在生物传感器上的应用[D].华东师范大学,2014.
[13]刘　芙,庞楚静萱,隋　鑫.农民新市民权利保护的法律问题研究[J].沈阳工业大学学报(社会科学版).
[14]王雪伟.服装的“寿命”[D].青岛大学,设计艺术学,2013,硕士.
[15]鲁劲松.多元主体参与的社会管理制度供给研究[D].三峡大学,马克思主义中国化,2013,硕士.
[16]眭俊.多孔硅的电化学制备及其性能研究[D].南昌航空大学,材料物理与化学,2013,硕士.
[17]潘婷.轻薄毛织物的缝纫平整度及其等级预测研究[D].浙江理工大学,服装设计与工程,2013,硕士.
[18]陈建飞.基于伪异步机制的柔性物体碰撞仿真[D].浙江大学,计算机应用技术,2013,硕士.
[19]贺亚妮.浅谈佛教的“圆融”精神在首饰中的运用[D].中央美术学院,首饰艺术设计,2013,硕士.
[20]吴悦.连翘酯苷对鸡胸腺组织中炎症因子及抗氧化的作用[D].东北农业大学,基础兽医学,2013,硕士.
[21]林少鹏.TNF-α抑制剂联合甲氨蝶呤治疗强直性脊柱炎的系统评价[D].福建医科大学,内科学,2014,硕士.
[22]刘玉龙.椭偏仪校准方法研究[D].中国计量科学研究院,测试计量技术及仪器,2014,硕士.
[23]邓灵斌.数字图书馆的管理研究[D].湘潭大学,2004.
[24]牛昊晗.我国新能源产业核心竞争力评价研究[D].陕西科技大学,会计学,2013,硕士.
[25]史岩峰.内蒙古高师音乐教育专业钢琴研究生培养模式探究[D].内蒙古师范大学,音乐学,2012,硕士.
[26]娄德君.近50年来黑龙江省的冷暖和旱涝变化[D].南京气象学院,气象学,2003,硕士.
[27]陈建球,唐涛,袁磊.改进ANP的无线闭塞中心管控能力评价模型[J].交通运输工程学报,2015,01:108-118.
[28]刘学士.高铁钢轨双砂轮跟进打磨机理及关键技术研究[D].浙江工业大学,机械电子工程,2012,硕士.
[29]彭伟清.社会心理学视域下的网络民粹主义研究[D].苏州大学,传播学,2014,硕士.
[30]周志翔.胃癌术后不同消化道重建对2型糖尿病疗效的对比研究[D].延安大学,外科学,2014,硕士.
[31]李锋.控制系统传感器鲁棒故障检测方法研究[D].华北电力大学（河北）,控制理论与控制工程,2004,硕士.
[32]杨超.基于躯感网的心电信号处理方法研究[D].东北大学,模式识别与智能系统,2010,硕士.
[33]马建斌.基于SVM的中文电子邮件作者身份挖掘技术研究[D].河北农业大学,2004.
[34]季娟.新疆厚皮甜瓜抗白粉病基因分子标记及生理小种的鉴定[D].新疆农业大学,植物病理学,2012,硕士.
[35]赵晓芳.中国古代瓷枕初步研究[D].内蒙古大学,考古学与博物馆学,2014,硕士.
[36]杨广斌.动态数据驱动的林火蔓延模拟系统关键技术研究[D].中国林业科学研究院,2008.
[37]郑淑梅.临近空间宽带射频前端技术研究[D].西安电子科技大学,电子与通信工程,2009,硕士.
[38]刘宇,栗然.数据仓库技术在发电厂中的应用研究[J].电力自动化设备,2004,09:18-20.
[39]孙细明,张晓鹏.基于信息熵的决策树算法实现[J].计算机与数字工程,2005,11:96-97+123.
[40]班超.河南永城一中多媒体历史教学调查研究[D].内蒙古师范大学,学科教学（专业学位）,2013,硕士.
[41]张泽暐.H公司业务流程再造研究[D].山东大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[42]代芳.初中语文阅读教学中的情境创设[D].渤海大学,学科教学（专业学位）,2014,硕士.
[43]葛慧.我国应收账款质押问题研究[D].河北大学,民商法学,2014,硕士.
[44]唐浩然.长沙市商业银行高管人员激励方案改进研究[D].湖南大学,工商管理,2013,硕士.
[45]李哲.影响透析患者血管内皮功能相关因素的探讨[D].河北医科大学,内科学（专业学位）,2014,硕士.
[46]刘晓辉.广东省集装箱港口群公路和水路集疏运系统建模与优化[D].华南理工大学,物流与供应链管理,2014,硕士.
[47]古旭.上海城市公园游客结构、行为与需求特征及其影响因素研究[D].华东师范大学,生态学,2013,硕士.
[48]周海灯.基于案例分析的网络造谣者特征研究[D].华中科技大学,公共管理,2013,硕士.
[49]国家电网公司”电网新技术前景研究”项目咨询组,王松岑,来小康,程时杰.大规模储能技术在电力系统中的应用前景分析[J].电力系统自动化,2013,01:3-8+30.
[50]焦维苍.中国双边投资条约核心条款研究[D].华中科技大学,法学,2013,硕士.