活性氧簇（ROS）介导的蛋白翻译后修饰调控肿瘤细胞死亡的作用及其机制研究

【摘要】研究目的：恶性肿瘤是严重威胁我国人民生命的重大疾病之一。作为恶性肿瘤治疗中的重要组成——化疗一直受到广泛的重视,而化疗药物也一直是药物研发的热点和重点。常用的抗肿瘤药物往往可以直接或间接地通过活性氧簇(ReactiveOxygenSpecies,ROS)来起到杀伤肿瘤细胞的作用,而一些病人对这些抗肿瘤药物的耐受也往往是由于一些抗氧化蛋白在肿瘤细胞内高表达所引起。ROS是一类含有氧的活性分子的总称,在生理条件下,ROS通常是有氧呼吸及有氧代谢的天然副产物,在细胞信号转导以及维持细胞稳恒中扮演着重要的角色；而在某些环境刺激下ROS会激烈产生,进而引起细胞内蛋白、细胞器以及DNA等相关生物结构的破坏。虽然激烈产生的ROS可以诱导细胞死亡,但是生理条件下的ROS却是十分重要的信号分子,可以调控细胞内的许多信号通路。最新研究表明ROS可以通过氧化修饰蛋白质,进而引发相关的生物学改变,但其中的分子机制尚未阐明。因此研究活性氧在诱导肿瘤细胞死亡过程中的机制,不仅有助于发现新的生命现象,更有机会发现其中可被人为干预的关键节点,从中发现潜在的抗肿瘤药物靶点,为研发新型抗肿瘤药物提供新思路。4-HPR(N-4-hydroxyphenylretinode,Fenretinide,4-羟苯基维胺脂)是合成的维甲酸衍生物,被公认是一种通过ROS发挥抗肿瘤活性的抗肿瘤药物。许多研究表明4-HPR具有肿瘤治疗作用,且在临床Ⅰ、Ⅱ期研究中发现4-HPR对多种肿瘤显示出了较好的抗肿瘤活性。鉴于ROS是4-HPR诱导肿瘤细胞死亡的重要原因,故我们拟以4-HPR作为分子探针,紧紧围绕蛋白质翻译后修饰这一环节开展系列研究,进一步探索ROS诱导的蛋白质翻译后修饰与抗肿瘤药物活性之间的联系。本课题的开展不仅有望阐明ROS诱导的蛋白质修饰调控抗肿瘤药物活性的分子机制,从中发现潜在的抗肿瘤药物药效学生物标记物,为氧化应激型抗肿瘤药物的临床应用提供指导,更有机会发现全新的抗肿瘤药物靶点,催生新型抗肿瘤治疗药物的研发。研究方法：1)研究抗肿瘤药物诱导的ROS对Akt蛋白翻译后修饰及其在诱导凋亡中的作用：细胞经AnnexinV-PI染色后采用流式细胞术检测细胞凋亡；细胞经JC-1染色后采用流式细胞术检测细胞内线粒体膜电位变化；应用Westernblotting检测PARP,caspase3、caspase9、Bax、Bcl-2、Akt、p-Akt(Ser473和Thr308)、GSK3β、p-GSK3β、.HSP90和PP2Ac等蛋白水平变化;应用免疫荧光法检测细胞内Akt蛋白与HSP90或PP2Ac蛋白的共定位变化；采用免疫沉淀法检测Akt蛋白与HSP90或PP2Ac蛋白的结合水平；采用汞溴红染色法检测细胞内二硫键生成水平；采用DCFDA染色结合流式细胞术检测细胞内ROS水平；采用自由巯基修饰剂NEM结合Westernblotting检测细胞内Akt蛋白的氧化还原状态；采用ELISA法检测不同氧化状态Akt蛋白与HSP90蛋白的结合能力；采用改良的自由巯基修饰结合Westernblotting检测细胞内Akt蛋白分子内二硫键的形成；应用NAC、GSH、DTT和catalase等多种抗氧化,检测对4-HPR诱导细胞凋亡的影响以及对Akt蛋白的影响；采用小鼠体内血糖变化实验,检测4-HPR体内对Akt蛋白的抑制作用。2)研究抗肿瘤药物诱导的ROSDJ-1蛋白的氧化态修饰及其在肿瘤自噬向凋亡转化过程中的作用：细胞经AnnexinV-PI染色后采用流式细胞术检测细胞凋亡；细胞经JC-1染色后采用流式细胞术检测细胞内线粒体膜电位变化；应用Westernblotting检测PARP、LC-3、DJ-1、ASK1、JNK、p-JNK、p38、p-p38、IRE1、eIF2α、p-eIF2α、ATF4、CHOP等蛋白水平变化；应用免疫荧光法检测细胞内DJ-1蛋白与ASK1蛋白的共定位变化；采用免疫沉淀法检测ASK1蛋白与DJ-1或Trx等其他蛋白的结合水平；采用DCFDA染色结合流式细胞术检测细胞内ROS水平；采用AO染色法、MDC染色法和GFP-LC3B转让法结合荧光显微镜检测细胞自噬泡的形成；应用电子显微镜观察细胞内自噬泡的形成以及凋亡的发生情况；建立裸小鼠移植瘤模型,周于评价不同剂量4-HPR对不同细胞之间的抗肿瘤作用；采用TUNEL法检测肿瘤组织中凋亡的发生；采用蛋白电泳结合蛋白质谱的方法鉴定与ASK1蛋白相互作用的蛋白；采用二维电泳法检测DJ-1蛋白的不同氧化状态；应用交联试剂DSS检测4-HPR作用后对细胞内DJ-1蛋白二聚化的影响；应用NAC、GSH等多种抗氧化,检测对4-HPR诱导细胞凋亡的影响以及对DJ-1蛋白的影响；采用SiRNA和ShRNA技术检测沉默DJ-1蛋白后对4-HPR诱导细胞凋亡的影响；应用Probe-1探针结合荧光显微镜检测细胞内氧化还原状态的变化；依据Ellman实验原理,检测细胞内GSH含量以及蛋白中自由巯基的含量；采用定点突变的方法建立突变型DJ-1质粒,随后考察过表达突变型DJ-1蛋白对4-HPR诱导细胞凋亡的影响。研究结果：第一部分：ROS调控AM蛋白分子内二硫键形成及其在抗肿瘤药物诱导白血病细胞凋亡中的作用研究.1)Akt蛋白的去磷酸化参与4-HPR诱导的白血病细胞凋亡4-HPR可呈时间及浓度依赖性地诱导白血病细胞凋亡,该过程伴随着线粒体膜电位变化以及线粒体通路相关蛋白的变化,提示线粒体通路介导的凋亡在4-HPR诱导NB4细胞死亡中发挥着重要的作用。进一步的研究发现,4-HPR诱导NB4细胞凋亡过程中可显著下调Akt蛋白丝氨酸473位点的磷酸化水平,但应用相应的信号通路抑制剂LY294002和激动剂Insulin后,发现这一过程并不依赖于PI3K。2)4-HPR诱导的ROS调控Akt蛋白磷酸化及其在细胞凋亡中的作用抗氧化剂NAC、GSH和DTT可完全抑制由4-HPR诱导产生的ROS也可降低其诱导NB4细胞凋亡的比例。进而发现抗氧化剂NAC、GSH以及DTT可显著甚至完全逆转4-HPR诱导NB4细胞内磷酸化Akt蛋白的下调。提示ROS在4-HPR诱导NB4细胞内磷酸化Akt蛋白下调中具有重要的作用。3)4-HPR诱导的ROS积蓄可调控Akt蛋白形成分子内二硫键采用改良的汞溴红染色法发现4-HPR可显著增加NB4细胞内蛋白质二硫键含量,这一现象可被抗氧化剂NAC所逆转。通过分析Akt蛋白的结构域以及晶体结构,发现位于激酶区的296和310位点半胱氨酸可能是ROS潜在的修饰位点。进一步应用自由巯基修饰剂NEM检测Akt蛋白的氧化还原状态,结果显示4-HPR作用后Akt蛋白被氧化,且在半胱氨酸296和半胱氨酸310位点之间形成了分子内二硫键。4)4-HPR调控Akt蛋白分子内二硫键的形成与Akt蛋白去磷酸化的关系4-HPR作用NB4细胞不同时间点后HSP90和PP2Ac蛋白表达无显著变化,但Akt蛋白与HSP90的相互作用明显减弱,与去磷酸酶蛋白PP2Ac的相互作用显著增强。免疫荧光也确证了Akt蛋白与HSP90蛋白、PP2Ac蛋白之间的相互作用。抗氧化剂NAC可显著逆转由4-HPR介导的Akt蛋白与HSP90、PP2Ac相互作用,提示这一过程与4-HPR诱导的ROS关系密切。双氧水作用于纯化的部分Akt1蛋白,随后检测与HSP90蛋白的相互作用,可发现氧化的Akt1蛋白与HSP90蛋白之间的相互作用明显减弱。上述结果充分说明Akt蛋白的氧化形式可以影响与HSP90蛋白的相互作用,进而影响其磷酸化水平。第二部分：ROS调控DJ-1蛋白氧化态在抗肿瘤诱导肿瘤细胞自噬／凋亡间转化中的作用研究1)ROS蓄积可介导肿瘤细胞自噬/凋亡转化研究发现随着4-HPR作用浓度的增加可诱导四株肿瘤细胞自噬向凋亡转化。采用了AO染色法、MDC染色法、过表达GFP-LC3和透射电镜等方法确证经5和10μM4-HPR作用的肿瘤细胞内可明显形成自噬囊泡,说明4-HPR诱导肿瘤细胞的自噬／凋亡转化是浓度“阈值”依赖性。通过裸小鼠荷人Hela移植瘤模型,进一步明确了4-HPR在体内同样可诱导肿瘤细胞自噬／凋亡间转化,且同样呈现剂量“阈值”的依赖性。进一步研究发现,不同浓度4-HPR均显著上调Hela细胞内ROS水平,但会引起细胞内不同程度的氧化还原状态。应用了NAC以及GSH两种自由巯基类抗氧化剂,结果显示2mMNAC或GSH在显著抑制10μM4-HPR诱导细胞凋亡的同时,不影响该浓度对自噬的诱导,但该浓度下的NAC却可以抑制4-HPR诱导的细胞自噬；而当细胞作用4mMNAC或GSH后可进一步抑制10μM4-HPR诱导的细胞自噬。这些结果均说明ROS上调是引起肿瘤细胞自噬／凋亡转化的原因。随后考察了不同浓度4-HPR作用下细胞内内源性GSH的含量以及细胞内蛋白质中自由巯基的含量。结果显示,5和10μM4-HPR作用后均可显著降低细胞内内源性GSH的含量和细胞内蛋白质中自由巯基的含量,且呈现时间依赖性关系,而10μM4-HPR较5μM4-HPR作用6小时后蛋白质中自由巯基含量显著降低。2)JNK1和p38信号通路分别介导ROS诱发的细胞自噬和凋亡研究发现5和10μM4-HPR作用可显著上调JNK1蛋白的磷酸化水平,提示JNK1在两个浓度下均可激活；但p38蛋白的磷酸化水平仅在10μM4-HPR作用后发生明显上调。提示JNK1和p38信号通路可能分别调控了4-HPR诱导的自噬和凋亡。应用SiRNA以及小分子抑制剂分别抑制JNK1和p38蛋白的表达和活性,结果显示,沉默或抑制细胞内JNK1蛋白后,可显著抑制自噬,而凋亡则被进一步加强,说明JNK1的沉默可显著抑制4-HPR诱导的细胞自噬,促进细胞凋亡；而沉默或抑制细胞内p38蛋白后,并不影响自噬,但可抑制凋亡的出现,提示p38参与了4-HPR诱导的细胞凋亡。沉默ASK-1不仅可抑制5和10μM4-HPR引起的JNK1蛋白激活,也可抑制10μM4-HPR引起的p38蛋白激活,提示4-HPR激活细胞内JNK和p38信号通路依赖于ASK1蛋白。3)ROS蓄积可影响DJ-1/ASK1蛋白复合物稳定性免疫沉淀结合SDS聚丙烯凝胶电泳分离实验发现,若干个蛋白在不同程度ROS的蓄积中呈现出与ASK1动态的相互作用。通过蛋白质谱的进一步鉴定,发现了5个蛋白中PARK7的得分最高。进一步采用免疫沉淀结合WesternBlotting技术进行检测,结果显示DJ-1蛋白(即PARK7)与ASK1蛋白的相互作用呈现出了先聚合后解离的作用模式。为确证这一有趣的现象,我们应用DJ-1蛋白抗体进行反向免疫共沉淀,结果同样显示随着Fenretinde浓度的增加,DJ-1蛋白与ASK1蛋白的相互作用呈现出了先聚合后解离的方式。免疫荧光数据则更进一步地确证DJ-1蛋白与ASK1蛋白的相互作用存在先聚合后解离的变化。我们应用了不同浓度的抗氧化剂NAC,发现NAC可显著调控DJ-1蛋白与ASK1蛋白的相互作用,提示当ASK1与DJ-1蛋白形成蛋白复合物时可介导细胞自噬的发生,而当DJ-1/ASK1蛋白复合物进一步解离时会启动细胞的凋亡程序。4)ROS调控的DJ-1蛋白氧化态在肿瘤细胞自噬／凋亡转化中的作用随着ROS浓度的增加,DJ-1蛋白等电点逐渐降低,提示其氧化态水平进一步提高。此外WesternBlotting结果显示,不同浓度4-HPR作用后对DJ-1蛋白的总蛋白并无显著变化,但10μM4-HPR作用下可显著抑制其二聚化形式的存在,提示此时DJ-1蛋白的活性受到抑制。我们应用DJ-1蛋白氧化态的稳定剂Compound23,发现其可以影响DJ-1蛋白与ASK1蛋白之间的相互作用,且此时ASK1下游的p38激活作用也被抑制,提示Compound23稳定DJ-1氧化态后,可通过维持与ASK1的相互作用抑制其下游p38的激活,但对JNK1的激活并不影响。我们的结果还进一步显示Compound23作用后可显著抑制10μM4-HPR诱导的细胞凋亡,但对细胞的自噬作用并不显著。通过构建两个突变型DJ-1蛋白,结合流式细胞术发现DJ-1蛋白106位点的氧化态受到4-HPR介导的ROS调控,从而影响其与ASK1蛋白的相互作用,最终决定是否启动p38信号通路激活凋亡。5)DJ-1蛋白的表达在肿瘤细胞对4-HPR敏感性中的作用由于我们发现肿瘤细胞对4-HPR的IC5o值与DJ-1蛋白的相对表达情况两者之间存在很好的线性相关性(R=0.815),因此我们应用SiRNA技术沉默细胞内DJ-1蛋白的表达,随后检测对4-HPR诱导自噬和凋亡的影响以及对JNKl和p38信号通路的影响。结果显示,沉默细胞内DJ-1蛋白后,可促进4-HPR诱导的细胞凋亡比例。进一步地,我们采用ShRNA技术构建了稳定低表达DJ-1蛋白的细胞,随后应用裸小鼠荷人肿瘤模型评价沉默DJ-1蛋白对4-HPR诱导自噬和凋亡的影响。结果同样发现沉默DJ-1蛋白可在体内外通过激活p38信号通路,增加细胞对4-HPR诱导凋亡的敏感性。6)内质网应激在4-HPR诱导的ROS诱发细胞自噬中的作用针对ROS导的细胞自噬,我们检测了不同浓度4-HPR作用细胞后对细胞内质网应激的影响,结果显示,ROS蓄积后可使XBP-1出现切割片段,提示此时IRE-1-XBP-1轴被激活；而仅在10μM4-HPR作用细胞后才使得eIF2α磷酸化水平及其下游ATF4、CHOP蛋白表达增加,提示仅高浓度ROS才激活eIF2α-ATF4轴。应用SiRNA技术敲低胞内IRE-1蛋白表达,随后给予不同浓度4-HPR,检测JNK1蛋白的激活情况,结果显示,沉默细胞内IRE-1蛋白表达后,可显著抑制ROS蓄积诱导的JNK1蛋白的激活,但对p38蛋白激活并无作用。此外,应用免疫沉淀结合WesternBlotting技术检测不同浓度的4-HPR作用下细胞内ASK1、TRAF2和IRE-1的相互作用情况。结果显示,在5和10μM4-HPR作用细胞后可使ASK1、TRAF2和IRE-1的相互作用得到显著加强,且两个剂量浓度变化相当。上述这些结果表明,ROS蓄积诱导的细胞自噬与内质网应激通路IRE-1-XBP-1密切相关。研究结论：本论文以可蓄积ROS的抗肿瘤药物4-HPR为小分子探针,将Akt蛋白和DJ-1蛋白作为突破口,较为系统的探讨了活性氧介导的蛋白翻译后修饰对肿瘤细胞活性的影响及其分子机制。(1)首次证实Akt蛋白的去磷酸化参与了抗肿瘤药物诱导肿瘤细胞凋亡,而ROS的积聚也可以对Akt蛋白进行氧化修饰,且在分子内形成二硫键；该分子内二硫键的形成会减弱Akt蛋白与HSP90蛋白的相互作用,但可增加与PP2Ac蛋白的相互作用,并最终影响其磷酸化。(2)首次发现DJ-1蛋白可以作为ROS感受器,感受肿瘤细胞内不同程度氧化应激状态：当细胞处于温和的氧化状态时(低水平ROS),DJ-1蛋白被轻度氧化,此时可与ASK1蛋白相互作用抑制p38信号通路的激活,维持JNK信号通路的激活,导致细胞自噬的发生；当细胞处于过度的氧化应激时(高水平ROS),DJ-1蛋白被高度氧化,DJ-1蛋白与ASK1蛋白解离,启动p38和JNK信号通路,使得细胞自噬向凋亡转化。本课题的开展不仅阐明了ROS介导的蛋白质翻译后修饰如何调控肿瘤细胞死亡的分子机制,而且发现了可进行干预的关键节点蛋白,这些结果为寻找氧化应激型抗肿瘤药物的药效学生物标记物、临床合用方案以及研发新型抗肿瘤药物提供了理论和实验基础。
【作者】曹戟；
【导师】杨波；
【作者基本信息】浙江大学，药理学，2013，博士
【关键词】4-HPR；氧化应激；蛋白质翻译后修饰；Atk蛋白；DJ-1蛋白；

【参考文献】
[1]谷筱玉.红外光谱法中药成分检测研究[D].天津大学,生物医学工程,2004,硕士.
[2]崔继永.挖掘机动臂结构及焊接工艺优化设计[D].山东大学,机械工程（专业学位）,2012,硕士.
[3]吴明飞.增强型协同信息获取及共享系统设计与实现[D].国防科学技术大学,计算机科学与技术,2012,硕士.
[4]龚伊婷.后危机时代新贸易保护主义的发展和我国的应对策略[D].华东师范大学,国际贸易学,2012,硕士.
[5]杨利.谯城区土地资源利用与发展休闲农业的研究[D].安徽农业大学,土地资源管理,2012,硕士.
[6]张存山.永磁无刷牵引电机电磁性能研究[D].北京交通大学,2006.
[7]尹航.基于五脏相关理论的哮病证候特点及哮喘宁颗粒剂的作用机理研究[D].北京中医药大学,中医内科学,2013,硕士.
[8]陈玲.我国环境教育立法研究[D].中南林业科技大学,环境与资源保护法学,2014,硕士.
[9]杨海生.基于起伏地表的合成炮叠前深度偏移[J].石油地球物理勘探,2007,04:380-386+488+355-356.
[10]谷岩,冯华.智能化城市防灾救灾应急处理支持系统的研究[J].计算机工程与设计,2005,06:1503-1505+1513.
[11]赵琦.X射线实时成像检测管外扫查器研究[D].东北石油大学,机械工程（专业学位）,2013,硕士.
[12]张雪贞.Narcotrend监测和丙泊酚血药浓度对耳鼻喉科微创手术静脉全身麻醉气管拔管时机判断的研究[D].广州医科大学,麻醉学,2013,硕士.
[13]张雪薇.包头市生态城市建设中产业升级的评价研究[D].内蒙古科技大学,区域经济学,2014,硕士.
[14]林丽.海事行政处罚自由裁量权的程序控制研究[D].兰州大学,行政法,2012,硕士.
[15]梅友忠.基于超级电容辅能的电动车驱动系统研究[D].中国矿业大学,电力电子与电力传动,2014,硕士.
[16]周玉坤.zigzag型石墨烯纳米带电学性质第一性原理研究[J].廊坊师范学院学报(自然科学版),2014,04:53-55.
[17]冯新康.直接冷却单色器晶体加工方法及其工艺的研究[D].中国科学院研究生院（上海应用物理研究所）,光学工程,2014,硕士.
[18]魏新,罗涛.基于模糊神经网络的应急物流系统中心选址模型研究[J].物流技术,2014,03:151-153.
[19]孙冀,杨学实,刘火林.变域传热发汗控制理论研究综述[J].控制与决策,2006,07:721-725+729.
[20]谢斌福.城市医疗废弃物回收处理模型应用及其回收网络优化研究[D].南京大学,计算机软件与理论,2013,硕士.
[21]覃万珂.白乳胶粘接强度的影响因素研究[D].广西大学,应用化学,2004,硕士.
[22]胡俊.基于博弈论的新型研发组织形成机理及组织模式研究[D].武汉理工大学,技术经济及管理,2012,硕士.
[23]张克新.Lemur酪氨酸激酶3在非小细胞肺癌患者血清和组织中的表达及临床意义[D].苏州大学,呼吸系病学,2014,硕士.
[24]曾言.嵊泗民宿室内设计研究与实践[D].浙江理工大学,艺术设计（专业学位）,2014,硕士.
[25]张国中,单雯妍,白雪峰.微波法制备金属硫化物光催化剂的研究进展[J].化学与黏合,2012,03:67-70.
[26]朱艳妮.《秘密花园》：社会空间中的自我建构[D].广西师范大学,英语语言文学,2013,硕士.
[27]刘金革.空港新城空间发展模式研究[D].北京建筑大学,城乡规划学,2013,硕士.
[28]胡愈,祁胜利,孙鸿宾,宋鹏程,陈可球,安变南,胡宁,蒋立军,杨玉璞.炉群调度管理专家系统[J].冶金自动化,1996,02:34-36.
[29]杨强.污染河流中脱氮微生物的筛选与固定化试验研究[D].郑州大学,环境工程,2013,硕士.
[30]赵国荣.义乌市商贸城可持续发展问题研究[D].西北工业大学,2005.
[31]黄晓敏.闽南茶区不同乌龙茶品种叶片显微结构比较研究[D].福建农林大学,茶学,2010,硕士.
[32]张卫钢.纯电动试验车及其相关技术研究[D].长安大学,2006.
[33]张苏楠.莎剧《奥瑟罗》的法律之维[D].山东大学,比较文学与世界文学,2013,硕士.
[34]辛廷慧.水下地形辅助导航方法研究[D].西北工业大学,控制理论与控制工程,2004,硕士.
[35]李果.辽宁省技术创新金融支持体系的研究[D].辽宁大学,国民经济学,2012,硕士.
[36]蔡静.避税动机对企业会计稳健性的影响[D].兰州商学院,会计学,2013,硕士.
[37]孙国伟.多弧离子镀制备TiZrN复合涂层及其性能的研究[D].东北大学,流体机械及工程,2010,硕士.
[38]王蓓蓓.基于巴拉萨—萨缪尔森假说的人民币实际汇率问题研究[D].天津财经大学,金融学,2012,硕士.
[39]李洪生.水下摄像机标定技术的研究[D].哈尔滨工业大学,控制工程,2013,硕士.
[40]陈智辉.江西省新时期农村扶贫开发对策研究[D].江西农业大学,农村与区域发展,2012,硕士.
[41]李丹.应用ARMS对成都及周边地区15个β地中海贫血家系进行基因分析[D].四川大学,儿科学,2003,硕士.
[42]王晓亮.藏羊和滩羊支气管树、支气管动脉铸型方法的建立及其整体结构研究[D].甘肃农业大学,发育生物学,2013,硕士.
[43]张玉林.神经网络在股市预测中的建模及应用[D].大连理工大学,计算数学,2004,硕士.
[44]武丹丹.Turbo码滑窗译码算法研究及FPGA实现[D].西安电子科技大学,电子与通信工程,2012,硕士.
[45]张岩.中国黄淮海夏玉米区玉米光温生产潜力时空演变特征模拟分析[D].南京农业大学,作物栽培学与耕作学,2013,硕士.
[46]许亮,李明,梁素田,侯耕.数据挖掘技术在电子商务中的应用[J].甘肃科学学报,2002,S1:17-20.
[47]赵苇苇.抵抗素样分子β参与2型糖尿病肾病早期发生机制及临床价值研究[D].复旦大学,内科学,2013,博士.
[48]周科.RoboCup小型组（F-180）足球机器人的运动控制和路径规划[D].浙江大学,控制理论与控制工程,2004,硕士.
[49]黄丽娟,林一雄,零东宁,罗小杰.酸甜排骨料理包加工工艺研究[J].轻工科技,2014,10:3-4.
[50]叶青.图象几何畸变的校正技术及其在汽车牌照识别系统中的应用[D].河北大学,通信与信息系统,2002,硕士.