Annexin A5基因沉默对Hep-2细胞凋亡的影响

【摘要】目的：（1）检测Hep-2细胞中annexinA5基因相关特异干扰小RNA（siRNA）转染效率,分析siRNA转入Hep-2细胞对其生长情况的影响。（2）从基因水平及蛋白水平检测当特异siRNA转入Hep-2细胞后,对annexinA5基因表达的影响。（3）分析当annexinA5基因沉默后对Hep-2细胞凋亡的影响,探索annexinA5基因与Hep-2细胞凋亡的关系。方法：（1）采用siDirectVersion2.0软件设计特异annexinA5小干扰片段（siRNA）,筛选出符合条件的片段,经Pubmed比对后;由TaKaRa公司进行荧光标记合成。采用含10%胎牛血清及1%青霉素链霉素的改良型RPMI-1640培养基培养人喉癌Hep-2细胞,使其铺板至70%-80%或刚好铺满且处于对数生长期;由脂质体Lipofectamine2000（Invitrogen，美国）结合siRNA载入Hep-2细胞中进行瞬时转染。采用荧光显微镜观察并记录siRNA转染情况,从而计算转染效率（荧光显微镜下直接计数法即镜下随机固定视野,计数一百个细胞,同时计数出其中荧光阳性的细胞计算百分率,至少重复三次）。（2）当annexinA5基因沉默后,采用半定量RT-PCR方法检测实验组Hep-2细胞中annexinA5基因是否明显低于对照组;并采用westernblotting检测实验组Hep-2细胞中annexinA5蛋白是否明显低于对照组。（3）细胞凋亡检测试剂盒（AnnexinV-FITC/PI）（Keygen公司,中国）检测annexinA5基因沉默后对实验组Hep-2细胞凋亡的影响,探索annexinA5基因功能与Hep-2细胞凋亡之间的关系。结果：（1）转染结束后;采用荧光显微镜观察并记录siRNA转染情况，从而计算转染效率;经直接计数法（重复三次）,转染效率达80%-90%。（2）半定量RT-PCR结果表明实验组annexinA5基因明显低于对照组。其中实验siRNA组、阴性siRNA组、脂质体组及空白细胞组的相对灰度值分别为0.70±0.03、1.18±0.05、1.17±0.06及1.23±0.07;经统计学分析表明实验组annexinA5在mRNA水平的灰度明显弱于阴性siRNA组（t=-14.77,P=0.001<0.05）、脂质体组（t=-13.23,P=0.001<0.05）及空白细胞组（t=-12.99,P=0.002<0.05）;而各对照组间差异无统计学意义（阴性siRNA组与脂质体组为t=0.31,P=0.77〉0.05、与空白细胞组为t=-0.98,P=0.39〉0.05、脂质体组与空白细胞组为t=-1.21,P=0.30〉0.05）。Westernblot结果表明实验组annexinA5基因蛋白表达明显低于对照组。其中实验siRNA组、阴性siRNA组、脂质体组及空白细胞组的相对灰度值分别为1.21±0.03、3.88±0.06、3.87±0.02及3.95±0.08；统计学分析表明annexinA5的蛋白的相对灰度值明显弱于阴性siRNA组（t=-70.34,P=0.000<0.05）、脂质体组（t=-150.62,P=0.000<0.05）及空白细胞组（t=-56.32,P=0.000<0.05）;各对照组间差异无统计学意义（阴性siRNA组与脂质体组为t=0.46,P=0.68〉0.05、与空白细胞组为t=-1.15,P=0.32〉0.05、脂质体组与空白细胞组为t=-1.77,P=0.21〉0.05）。（3）AnnexinV-FITC法结果提示当annexinA5基因沉默后，人喉癌细胞Hep-2凋亡率明显降低。实验siRNA组、阴性siRNA组、脂质体组及空白细胞组分别为4.43±0.12、13.67±0.22、13.66±0.12及13.35±0.13;实验组细胞Hep-2凋亡率（4.43%±0.12）较阴性siRNA组（t=-62.50,P=0.000<0.05）、脂质体组（t=-14.16,P=0.005<0.05）及空白细胞组（t=-11.47,P=0.007<0.05）明显降低,差异具有统计学意义;各对照组间差异无统计学意义（阴性siRNA组与脂质体组为t=0.03,P=0.98〉0.05、与空白细胞组为t=0.42,P=0.72〉0.05、脂质体组与空白细胞组为t=0.31,P=0.77〉0.05）。结论：本研究证实在人喉癌Hep-2细胞中，当annexinA5基因沉默后;人喉癌细胞Hep-2凋亡率明显降低。而肿瘤细胞凋亡发生改变对肿瘤的克隆性生长中起着重要作用,以及对肿瘤的诊断、治疗、甚至预后都起着举足轻重的作用。而研究表明annexinA5基因可促进Hep-2细胞的凋亡,这可能成为喉癌诊断,治疗及预后的新的生物靶标。
【作者】刘杨；
【导师】刘海；
【作者基本信息】川北医学院，耳鼻咽喉科学，2014，硕士
【关键词】Hep-2细胞；AnnexinA5基因；凋亡；

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