猫多能性基因慢病毒表达载体的构建与鉴定

【摘要】本试验采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）获取猫Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc目的基因，根据NCBI公布的猫Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc基因序列设计合成了上、下游引物，并导入相应的酶切位点及保护碱基，Oct4基因上下游引物分别加上NotI和BamHI酶切位点，Sox2、Klf4和c-Myc基因上下游引物分别加上NotI和NsiI酶切位点。将扩增的基因片段连接T载体pUC57。酶切载体LV5和含目的基因的表达质粒，将目的基因与携带绿色荧光蛋白（GFP）的慢病毒载体LV5进行定向连接，构建慢病毒表达载体LV-Oct4、LV-Sox2、LV-Klf4和LV-c-Myc。将其连接产物分别转化至细菌感受态细胞中，经筛选阳性克隆、酶切鉴定后送测序，并通过lipofectamine2000介导将重组质粒LV-Oct4、LV-Sox2、LV-Klf4和LV-c-Myc转染293T包装细胞对慢病毒进行包装转染并收集病毒上清测定病毒滴度，取得以下实验结果：（1）本试验成功克隆出猫Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc基因。采用逆转录聚合酶链反应的方法分别扩增出片段大小为1083bp，966bp，1458bp，1326bp的猫Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc基因，把扩增出的猫Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc基因连接T载体进行鉴定和测序，结果与GenBank参考序列比对分析发现所克隆的猫Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc基因即为我们的目的基因。（2）经双酶切鉴定及测序分析，构建出正确的猫LV-Oct4、LV-Sox2、LV-Klf4及LV-c-Myc慢病毒表达载体，基因测序结果与目标序列完全一致，并将重组质粒转染包装293T细胞，转染24-48h在荧光显微镜下观察GFP的表达情况，可见293T细胞生长状况良好，且转染LV-Oct4、LV-Sox2、LV-Klf4及LV-c-Myc重组质粒的293T细胞表达GFP，以上结果表明成功构建了含有猫Oct4、Sox2、Klf4及c-Myc基因的慢病毒表达载体。（3）重组慢病毒载体质粒LV-Oct4、LV-Sox2、LV-Klf4及LV-c-Myc经293T包装细胞转染包装，产生了具有感染性的病毒颗粒，且病毒滴度均达到107TU/ml以上，获得了稳定产生慢病毒颗粒的包装细胞株。
【作者】樊晓烨；
【导师】任文陟；
【作者基本信息】吉林大学，动物学，2014，硕士
【关键词】猫；慢病毒载体；多能性基因；载体构建；

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