肠清口服液对溃疡性结肠炎的防治作用及机制探讨

【摘要】肠黏膜屏障在预防微生物及毒素由肠腔侵入机体方面发挥重要作用。在溃疡性结肠炎(ulcerativecolitis,UC)疾病中,肠道粘膜屏障功能呈现不同程度的受损,菌群失调,大量内毒素和(或)病原微生物等容易经受损肠黏膜进入体循环,通过多种机制增加肠粘膜通透性,诱发和(或)加重肠道炎症和免疫反应。因此,修复肠黏膜屏障有利于控制或减轻肠黏膜炎症和免疫反应,是治疗UC的重要方法之一。肠清口服液由中国科学院南海海洋研究所提供,属于待申请专利的药物,其药物成分暂不能提供,对其是否具有改善UC以及肠黏膜通透性的作用国内外尚无报道。本研究探讨肠清口服液对UC小鼠肠黏膜通透性的影响及其作用机制对治疗UC(UC)药物的评价,对UC发病机制的研究及治疗UC药物的研发均具有重要的理论和实际意义。目的：运用TNBS造雄性Balb/c小鼠UC模型,探讨肠清口服液对UC的治疗作用,在此基础上进行肠清口服液对UC防治作用的机制研究。方法：一、肠清口服液对TNBS诱导小鼠UC的防治作用研究5%三硝基苯磺酸(TNBS)与无水乙醇以1：1比例混匀,按造模剂量150mg/kg对♂Balb/c小鼠进行造模,将造模后的实验动物进行分组：♂Balb/c小鼠共84只,随机分成正常对照组、模型对照组、柳氮磺吡啶肠溶片组、受试肠清口服液10、20、30倍剂量组。每天观察各组小鼠的体重变化,粪便性状以及潜隐血以此计算各组小鼠每天疾病活动指数(DAI),于第三天处死小鼠,取结肠部位,进行结肠病变程度肉眼评分,以及病理学评分。通过观察肠清口服液对TNBS诱导UC小鼠的疾病活动指数(DAI),结肠病变程度的影响,对其抗UC的作用作出科学的评价。二、观察肠清口服液对TNBS诱导的UC♂Balbc小鼠结肠黏膜通透性的影响。运用Elisa方法检测各组Balbc小鼠血浆二胺氧化酶(DAO)活性,探讨肠清口服液对UC小鼠结肠组织黏膜通透性的影响。三、探讨肠清口服液影响TNBS诱导的UC♂Balbc小鼠结肠粘膜通透性的作用机制运用RT-qPCR及WesternBlot检测方法,观察各组小鼠结肠部位zo-1、occludin、claudin-1的基因表达与蛋白表达,研究紧密连接相关蛋白zo-1、occludin、claudin-1在不同实验处理小鼠结肠中的表达情况,为肠清口服液改善结肠通透性作用提供机制研究。四、在Caco-2细胞上探讨肠清口服液影响肠道粘膜通透性的作用机制建立Caco-2细胞屏障模型,评估肠清口服液对LPS负荷下的Caco-2细胞通透性的影响,以occludin,claudin-1、ZO-1蛋白表达作为评价指标,在细胞水平上,探讨肠清口服液对炎症肠道屏障通透性的影响机制。结果一、肠清口服液对TNBS诱导8Balbc小鼠UC的防治作用研究肠清口服液各剂量组的小鼠DAI、结肠病变肉眼评分、结肠病理学评分结果均显著低于模型组(P<0.05),且在实验剂量范围内呈现一定的量效关系。二、观察肠清口服液对TNBS诱导的UC♂Balbc小鼠结肠黏膜通透性的影响肠清口服液高、中剂量组能明显降低UC小鼠血浆中DAO的活性,与模型组比较差异显著(P<0.01)。三、肠清口服液对TNBS诱导的UC♂Balbc小鼠结肠粘膜通透性的作用机制研究RT-qPCR结果显示,肠清口服液高剂量能明显升高UC小鼠结肠claudin-1mRNA的表达,与模型组比较差异显著(P<0.01)；肠清口服液高、中剂量组能明显升高UC小鼠occludinmRNA的表达,与模型组比较差异显著(P<0.01)；肠清口服液高、中、低剂量能明显升高UC小鼠ZO-1mRNA的表达,与模型组比较差异显著(P<0.05)。WesternBlot结果显示,肠清口服液高剂量能明显升高UC小鼠结肠claudin-1蛋白的表达,与模型组比较差异显著(P<0.01)。肠清口服液高、中、低剂量能明显升高UC小鼠occludin与zo-1蛋白表达水平,与模型组比较差异有显著性意义(P<0.05)。四、建立Caco-2屏障模型验证肠清口服液影响通透性的作用机制培养20天后,Caco-2细胞排列整齐,边缘清晰,跨膜电阻大于500Ω,表明细胞排列非常紧密,可以用于体外屏障通通透性的研究,通过WesternBlot结果显示,肠清口服液可以明显提高LPS负荷下的Caco-2细胞claudin-1、zo-1及occludin蛋白的表达量,相对于模型组表达差异显著(P<0.05)。结论：本研究运用TNBS诱导的♂Balb/c小鼠UC模型,探讨了肠清口服液治疗UC的治疗作用及其机制。肠清口服液改善了由UC引起的少食懒动、体重下降、稀便血便等状况,降低小鼠DAI以及结肠病变程度,表明对UC起到良好的防治作用。肠清口服液有效降低了UC小鼠血浆中的DAO活性,表明肠清口服液在小鼠UC中的作用机制与肠道粘膜通透性有密切关系。给予肠清口服液后,UC小鼠结肠组织以及Caco-2细胞中紧密连接蛋白zo-1、occludin、claudin-1的mRNA及蛋白表达量上调,与模型组比差异显著,体内体外实验结果基本一至,表明肠清口服液是通过调节紧密连接蛋白zo-1、occludin、claudin-1的表达,从而改善了小鼠肠道粘膜通透性,进而起到了改善♂Balb/c小鼠UC的作用。本研究为肠清口服液的临床研究提供了较为全面地实验依据。
【作者】顾鉴秋；
【导师】吴清和；
【作者基本信息】广州中医药大学，中药学，2014，博士
【关键词】溃疡性结肠炎；TNBS；zo-1；occludin；claudin-1；肠粘膜通透性；

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