水稻细菌性条斑病菌中受DSF群体感应系统调控的外泌蛋白的功能研究

【摘要】小分子DSF（DiffusibleSignalFactor）介导的群体感应（Quorumsensing,QS）系统在黄单胞菌的侵染和致病过程中具有关键作用,但DSF调控的外泌蛋白的种类和功能仍不清楚。由稻黄单胞菌稻生致病变种（Xanthomonasoryzaepv.oryzicola,Xoc）引起的水稻细菌性条斑病是我国水稻生产上一种重要的细菌病害。本研究以Xoc为对象,研究受DSF调控的外泌蛋白的种类、致病功能及机制,研究结果如下：（一）本实验室赵延存博士的前期研究中鉴定了Xoc中受DSF调控的53个外泌蛋白（赵延存论文,2011）。本研究选取了其中15个感兴趣的目标蛋白用于后续研究。这15个蛋白的功能涉及小分子蛋白介导的群体感应、细胞结构、细胞进程、氧化压力环境的适应、中间代谢、蛋白降解以及功能未知的蛋白。采用基因定向缺失技术,对这15个蛋白的编码基因进行敲除,获得相应的基因缺失突变株。致病性测定显示其中4个突变株显著削弱了Xoc对寄主水稻的致病性,其对应的蛋白/基因分别是XOC0319（Ax21同系物,依赖XA21的水稻免疫激发子）、XOC2128（多聚半乳糖醛酸酶）、XOC3806（蛋白酶）和XOC1601（半胱氨酸蛋白酶）。表型分析表明,这4个基因对Xoc的定殖能力、胞外多糖产量、游动性、生物膜的形成、胞外蛋白酶活性、抗氧化压力等毒力相关表型造成了不同程度的影响。具体结果如下：这4个基因的突变没有影响Xoc的生长速率,但影响了Xoc在水稻中接种发病后的定殖量,同时还均降低了胞外多糖的产量。XOC2128和XOC1601的突变减弱了菌体游动性,XOC0319的突变减弱了生物膜的形成,XOC3806和XOC1601的突变减弱了胞外蛋白酶活性,XOC3806和XOC2128的突变使Xoc的抗氧化压力能力有所增强。荧光定量显示这四个基因在Rs105△rpfF的表达水平在一定程度上取决于培养基的营养状况,相关结果和Rs105△rpfF中差异蛋白表达情况不完全一致；同时我们还发现这四个基因对10个已知的致病相关基因存在一定的转录调控作用。xpsE是Ⅱ型分泌系统关键基因,荧光定量PCR还显示Rs105△rpfF中xpsE的转录表达水平显著下降,说明DSF群体感应系统对Ⅱ型分泌系统的功能存在某种程度的调控作用。此外,Ax21（水稻XA21先天免疫激发子）是Xoo泌出的能在依赖XA21的水稻上激发先天免疫的硫化蛋白,并且Ax21还被认为是Xoo中一种新型群体感应的信号分子；XOC0319就是Ax21在Xoc的同系物,本研究说明这两种QS系统的功能很可能存在交叉和联系。本研究是黄单胞菌中第一次对受DSF介导的群体感应调控的外泌蛋白及其功能进行了系统深入分析,相关结果显示了DSF型群体感应系统对11分泌系统毒力因子及AX21介导的群体感应有重要的调控作用,进一步明确了Xoc中DSF型群体感应系统的功能。（二）病原菌在寄主表面的黏附性是其成功侵染的先决条件,主要在细菌黏附、定殖等侵染早期进程中起重要作用,而这个过程是由被称为黏性因子的蛋白质来完成的。因此我们选择了T5SS泌出的两个非菌毛黏性蛋白XadA、YapH进行研究,对相关基因xadA、yapH进行了缺失敲除,并对它们的致病机制及其与DSF型群体感应系统的关系进行了试验和分析。XadA和YapH是通过V型分泌系统泌出的两个黏性蛋白。我们找到了xadA、yapH的同系物,即XOC、808、XOC、2467,然后构建了缺失突变体△xadA、△yapH。致病相关表型的测定的结果显示这两个黏性蛋白均和Xoc的喷雾接种时的致病性、水稻叶片表面黏附性、胞外多糖合成能力相关,但与非生物表面的黏附性无关。实时定量荧光PCR表明,xadA、yapH的在模拟植物汁液的培养条件下的转录表达水平的变化存在差异,其中yapH能够被这种培养基诱导表达；xadA、yapH的转录表达受DSF型群体感应通路调控的模式不同,其中yapH受rpfF、clp正向调控,xadA受rpfF、clp负向调控,说明DSF群体感应系统很可能与外泌黏性蛋白功能的发挥密切相关。本研究首次为XadA、YapH在Xoc致病过程中的作用和特点提供了参考。
【作者】周奕景；
【导师】刘凤权；
【作者基本信息】南京农业大学，植物病理学，2013，硕士
【关键词】水稻细菌性条斑病菌；群体感应；外泌蛋白；功能研究；

【参考文献】
[1]CB聿伯,彭世蕃.后张法予应力混凝土梁[J].南昌水专学报.1982(00)
[2]宗世慧.高强度聚焦超声治疗外阴上皮内非瘤样病变前后雌、孕激素受体及Survivin的表达及意义[D].泰山医学院,妇产科学,2012,硕士.
[3]张爽.高清海类哲学的逻辑特质与人性价值探析[D].吉林大学,马克思主义哲学,2014,硕士.
[4]闫文华,张万福,张立新,陈迎楠.二连盆地赛汉塔拉凹陷地质综合评价及目标优选[J].石油地球物理勘探,2008,S1:139-145+196+12-13.
[5]李漫漫.基于生命周期的科技型中小企业绩效评价体系研究[D].山东财经大学,会计学,2014,硕士.
[6]赵祉霖.体育教育专业实习生教学能力分析与发展情况研究[D].沈阳体育学院,体育教育训练学,2014,硕士.
[7]师铮.基于BP神经网络的研发人员能力评价方法研究[D].大连理工大学,控制理论与控制工程,2013,硕士.
[8]薛倩倩.岩溶槽谷地下河系统动态变化及含水介质各向异性对比研究[D].西南大学,第四纪地质学,2014,硕士.
[9]陶满星.促进学生自主学习的英语教、学策略的研究[D].贵州师范大学,课程与教学论,2004,硕士.
[10]张晶晶,张礼敬,陶刚.人的可靠性分析研究[J].中国安全生产科学技术,2011,01:76-81.
[11]史帅.羽扇豆醇对肝癌细胞株HepG2抑制作用的研究[D].河北医科大学,外科学,2014,硕士.
[12]王巍.钌配合物的制备及其在氢转移催化氢化反应中的应用[D].长春工业大学,化学工程,2013,硕士.
[13]姜文玉.韩语副词状语在汉语中的对应形式[D].吉林大学,语言学及应用语言学,2004,硕士.
[14]王夏薇.新闻侵权的抗辩事由研究[D].苏州大学,民商法学,2014,硕士.
[15]韩乐园.Mg基材料添加剂对LiBH_4配位氢化物吸放氢性能的影响机制研究[D].浙江大学,材料科学与工程,2013,硕士.
[16]徐利.红景天多糖对猪MⅡ期卵母细胞体外成熟及玻璃化冷冻的影响[D].上海海洋大学,临床兽医学,2013,硕士.
[17]王超.城市智能交通数据处理优化设计[D].河南科技大学,计算机技术（专业学位）,2014,硕士.
[18]米江辉.线载荷作用下轴向运动薄板的非线性共振[D].燕山大学,一般力学与力学基础,2014,硕士.
[19]王科.何处安放“我”的家[D].首都经济贸易大学,社会工作（专业学位）,2013,硕士.
[20]马瑶.行政决策中的公民网络参与研究[D].河北大学,行政管理,2014,硕士.
[21]张智军,张立明,黄洁,夏景光.基于氧化石墨烯的新型功能纳米载体的制备及其应用研究[A].中国化学会.中国化学会第27届学术年会第04分会场摘要集[C].中国化学会:,2010:1.
[22]张帆,朱红涛.基于关键词的网络信息检索优化探索[J].情报科学,2005,06:912-916.
[23]苏雯.Intermedin后处理对大鼠肾脏缺血再灌注损伤后血管新生及其机制的实验研究[D].山西医科大学,内科学,2013,硕士.
[24]曲佳.矽肺发生发展过程中MMP-9、MMP-2变化规律研究[D].济南大学,劳动卫生与环境卫生学,2012,硕士.
[25]郭春龙.唐山市社区户外健身空间规划策略研究[D].河北师范大学,体育教育训练学,2014,硕士.
[26]马越.基于ACR9000齿轮测量中心控制系统的研究与开发[D].哈尔滨理工大学,模式识别与智能系统,2012,硕士.
[27]刘春秋.360度物体三维测量方法研究[D].哈尔滨理工大学,信号与信息处理,2012,硕士.
[28]刘兴华.长沙电信产品经理负责制实施研究[D].湖南大学,2005.
[29]王琦桐.纳米石墨微片/金属酞菁/聚偏氟乙烯三元复合材料的制备及性能研究[D].吉林大学,高分子化学与物理,2014,硕士.
[30]董志广.大路不平我来铲——平地机控制系统概述[J].交通世界.2001(07)
[31]胡望斌,朱东华,汪雪锋.基于技术监测理论的奥运科技分析与评估方法研究及应用[J].中国软科学,2004,12:131-137.
[32]党晓岚.基于品牌生态系统的陕西汽车集团有限责任公司品牌建设研究[D].陕西科技大学,企业管理,2013,硕士.
[33]韩邦琦.新型引发剂的制备及引发甲基丙烯酸甲酯聚合研究[D].北京化工大学,化学,2013,硕士.
[34]韩俊波.高校信息化网络体系设计与安全研究[D].安徽大学,计算机技术,2014,硕士.
[35]宁军楠.洛川黄土剖面地层CBR值分布规律研究[D].长安大学,交通运输工程（专业学位）,2014,硕士.
[36]郑艳.合并对价分摊中的无形资产评估研究[D].北京交通大学,资产评估（专业学位）,2013,硕士.
[37]周炜.基于存储虚拟化的快照与CDP设计[D].湖南大学,计算机应用技术,2011,硕士.
[38]郭朝晖,赵立群.现场总线在数字式直流传动系统中的应用[J].有色冶金设计与研究.2003(S1)
[39]庄红舞.供应链管理下的采购研究[D].东华大学,企业管理,2004,硕士.
[40]刘翻艳.堇青石表面改性对Pd基整体式催化剂结构和性能的影响[D].北京化工大学,化学工程与技术,2013,硕士.
[41]肖丽微.玉米秸杆生物碳质对甲基叔丁基醚和苯的吸附实验研究[D].中国地质大学（北京）,地下水科学与工程,2013,硕士.
[42]励佳.硫酸根自由基与联苯的反应研究[D].复旦大学,环境工程,2010,硕士.
[43]许欢.当涂县S小区失地农民生活状况调查报告[D].安徽大学,社会工作,2013,硕士.
[44]丛林.山区高填方路堤沉降规律及稳定性分析[D].湖北工业大学,结构工程,2013,硕士.
[45]张华鑫.基于TD/GSM网络架构下的短信下发延时优化技术[D].内蒙古大学,电子与通信工程,2013,硕士.
[46]蒋双喜.集团公司预算管理系统的设计与实现[D].湖南大学,软件工程,2013,硕士.
[47]郭俐彤.基于底盘集成控制的SUV主动防侧翻系统研究[D].吉林大学,车辆工程,2013,硕士.
[48]曹传顶.3%氯化钠对脂多糖小鼠脑水肿的保护作用及非渗透机制研究[D].中南大学,临床医学,2014,博士.
[49]王国明,简祯富.台湾工业工程理论及应用发展回顾[J].工业工程与管理,2003,03:1-5+23.
[50]武云霞.超声和电生理检查在肘管综合征中的相关性研究[D].泰山医学院,神经病学,2012,硕士.