SmD1蛋白表达与免疫原性研究及其抗体检测初步应用

【摘要】目的：采用基因工程技术,获取原核表达和真核表达的SmmDl重组蛋白,观察两者免疫原性和抗原性的差异。探索SmD1蛋白在免疫过量的情况下,诱导抗dsDNA抗体和其它抗核抗体产生的可能性,为寻找系统性红斑狼疮的启动原及发病机理提供实验依据；最后,以昆虫细胞表达的SmD1蛋白为抗原,研制抗SmD1抗体测定酶联免疫试剂,并进行初步的应用评价。方法：以化学合成方法获得目的基因,经PCR扩增,测序正确后,分别克隆到原核表达载体pET-21a和真核表达载体pFastBacTM1上,成功构建了重组质粒pET-21a-SmD1和pFastBacTM1-SmD1。(1)原核表达：将质粒pET-21a-SmD1转化到大肠杆菌BL21,选取阳性克隆,16℃低温条件下,1mmolIPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳鉴定重组蛋白,Ni-NTA亲和层析柱纯化。(2)真核表达：将质粒pFastBacTM1-SmD1转化到DH10Bac,蓝白斑筛选阳性克隆,获得重组穿梭载体Bacmid,转染昆虫细胞Sf9,接着进行重组杆状病毒的扩增,目的蛋白表达,SDS-PAGE电泳鉴定重组蛋白,Ni-NTA亲和层析柱纯化,Westernblot验证。(3)免疫原性研究：将原核表达蛋白和真核表达蛋白以皮下多点注射方式免疫4周龄Balb/c雌鼠,每隔两周免疫一次,共免疫三次,在第0周、2周、5周和9周,取小鼠血清,ELISA检测抗dsDNA抗体IgG,LIA法检测ANA谱,第9周处死,取脾脏T淋巴细胞,ELISPOT检测分泌IFN-yT淋巴细胞的频数,流式细胞术检测脾T淋巴细胞亚群CD3、CD4和CD8的比例及CD3+CD4+/CD4+CD8+的比值。(4)建立检测抗SmD1抗体的间接ELISA方法,检测553例各类型自身免疫性疾病患者血清,其中230例SLE。结果：经DNA序列分析和双酶切鉴定证实了重组质粒pET-21a-SmD1和pFastBacl-SmD1构建正确,并且分别在大肠杆菌BL21和杆状病毒／昆虫细胞系统(AcMNPV/Sf9)表达成功,获得目的蛋白。经Ni-NTA亲和层析柱高效分离带HIS标签的重组蛋白SmD1,纯度大于95%。经Bradford法测定,大肠杆菌表达的重组蛋白浓度为0.62mg/mL,昆虫细胞表达的重组蛋白浓度为0.908mg/mL。免疫原性研究发现,同时期,昆虫细胞Sf9表达的SmD1蛋白诱导抗Sm抗体和抗dsDNA抗体滴度比大肠杆菌BL21表达的蛋白诱导的抗体滴度高。Sf9表达的SmD1蛋白诱导抗dsDNA抗体滴度于第二次免疫后1周(第5周)达到顶峰,之后逐渐下降,而BL21表达的SmD1蛋白诱导的抗dsDNA抗体滴度在9周之内,滴度随时间的延长不断增加。抗dsDNA抗体在各组中的差异均有统计学意义。同时,SmD1重组蛋白也会诱导IgG抗SSA/60抗体、抗SSA/52抗体、抗SSB抗体、抗Scl-70抗体和抗U1-snRNP抗体的产生。在SmDl免疫过量的情况下,原核蛋白免疫组、真核蛋白免疫组的CD4+/CD8+平衡失调,与对照组比较,CD3+CD4+值下降,CD3+CD8+值升高,CD3+CD4+/CD3+CD8+比值下降。发现原核蛋白免疫组、真核蛋白免疫组的IFN-γ分泌T细胞频数显著高于对照组,两蛋白免疫组间的差异无统计学意义。以Sf9表达的SmD1蛋白为原料研制的抗SmD1抗体定量检测酶免试剂的准确性、重复性、检测限、线性和稳定性均符合YY/T1183-2010酶联免疫吸法检测试剂行业标准。临床应用结果显示,抗SmD1抗体对SLE灵敏度为57.8%,特异性为96.4%。结论：AcMNPV-sf9表达的SmD1蛋白的免疫原性和抗原性均比大肠杆菌BL21表达的SmDl蛋白强,前者还会与抗dsDNA抗体结合,与构象表位不同有关。SmD1蛋白量的增加会出现表位扩展现象,诱导抗dsDNA抗体等多种抗核抗体的产生,提示SmmD1自身抗原量的增加可能会诱导狼疮样自身免疫病的发生。自研的抗SmD1抗体酶联免疫试剂具有良好的临床应用价值,有助于SLE的辅助诊断。
【作者】钟运华；
【导师】庄俊华；
【作者基本信息】广州中医药大学，中西医结合基础，2014，博士
【关键词】系统性红斑狼疮；SmD1；原核表达；真核表达；免疫原性；抗SmD1抗体；

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