霍乱弧菌中受毒力相关蛋白调控的过氧化物酶TagD抵御氧胁迫的机制及其生理功能的研究

霍乱弧菌中受毒力相关蛋白调控的过氧化物酶TagD抵御氧胁迫的机制及其生理功能的研究

作者:师大云端图书馆 时间:2017-08-09 分类:硕士论文 喜欢:2187
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【摘要】霍乱是一种古老且流行广泛的急性肠道感染烈性传染病,其病原体是霍乱弧菌(Vibriocholerae).霍乱的临床特征是分泌性腹泻,粪便为米泔样,并伴有呕吐。导致病人迅速脱水和体液电解质缺乏,严重时可导致病人产生肌无力甚至休克死亡。霍乱弧菌属于革兰氏阴性细菌,菌体短小,附着有单鞭毛和菌毛,其致病力主要由霍乱毒素和毒素共调节菌毛介导。病原微生物在入侵和感染宿主时,宿主细胞会启动抵御机制,产生大量ROS破坏病原微生物的膜脂、蛋白质、DNA及其它细胞组分,从而杀死病原微生物。而病原微生物会产生多种酶类来抵御宿主细胞产生的ROS以保证感染效率,这些酶类中有一类为巯基过氧化物酶(Tpx)。该类酶的大小约为20kDa,通常具有两个决定蛋白质功能的半胱氨酸残基。对于Tpx的研究在大肠杆菌、沙门氏菌、幽门螺旋杆菌等细菌中进行得比较广泛和深入,而在霍乱弧菌中的研究尚未有报道,并且表达该蛋白质的基因tagD(vc0824)位于基因组中的流行性致病岛内,是受ToxR调控的下游基因之一,因此本实验以霍乱弧菌巯基过氧化物酶TagD作为研究对象。利用框内敲除的方法构建霍乱弧菌tagD突变株。发现在普通培养条件下,突变株与野生型菌株对氧胁迫的敏感性没有差异;但在毒力基因诱导表达的培养条件下,突变株与野生型菌株相比对氧胁迫更敏感。在过氧化物酶中半胱氨酸残基对其清除过氧化物的能力至关重要,因此构建TagD蛋白的半胱氨酸残基定点突变的菌株,检测其在毒力基因诱导表达条件下对H202的敏感性。发现TagD蛋白质第59和93位Cys残基点突变为丝氨酸后,突变菌株对H202的敏感性与tagD缺失菌株相同,说明了Cys59和Cys93残基是决定TagD蛋白质清除过氧化物能力的关键氨基酸位点。在毒力诱导表达培养基中,tagD突变株表现出了对氧胁迫的敏感性,且有报道tagD受ToxR的调节,同时在霍乱弧菌中ToxR还调节ToxT。通过构建Luminescence报告基因菌株以及DNaseIFootprint实验,发现tagD也受到ToxT的调节,并且ToxT的表达对霍乱弧菌抗氧胁迫的能力也有一定的影响,揭示了ToxR通过下游调控蛋白ToxT实现对tagD的调控。进一步的细菌双杂交实验发现TagD蛋白自身可以形成同型二聚体,但在氧胁迫条件下,该蛋白二聚体化的能力明显减弱,说明TagD蛋白在其清除过氧化物过程中单体是其主要的活性形式。在乳鼠小肠定殖实验中,tagD缺失菌株与野生型菌株的定殖能力没有显著差异;但在氧胁迫较高的斑马鱼的肠道定殖实验中,单独接种条件下,tagD缺失菌株的定殖能力弱于野生型菌株,而在混合接种条件下,两者没有差异。说明该蛋白主要在高氧胁迫条件下对霍乱弧菌的定殖发挥作用。综上所述,在霍乱弧菌中受毒力基因调控的过氧化物酶TagD对于细胞抵御氧胁迫和致病性的产生至关重要。
【作者】陆路;
【导师】朱军;王卉;
【作者基本信息】南京农业大学,微生物学,2013,硕士
【关键词】霍乱弧菌;巯基过氧化物酶;氧胁迫;定殖;

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