从三条通路研究黄芩苷干预LPS+Ac-LDL所致巨噬细胞凋亡相关AS的作用机制

【摘要】目的：通过体外培养小鼠巨噬细胞RAW264.7,并通过LPS+Ac-LDL构建炎症复合高脂的细胞环境,诱发巨噬细胞凋亡,运用清热解毒药的代表药黄芩的主要成分黄芩苷对其进行干预,通过westernblot及免疫荧光技术观察内质网应激诱导的巨噬细胞凋亡的三条主要通路JNK,P38,SRA信号通路以及细胞存活因素IFN-β的蛋白表达和mRNA表达,评价黄芩苷对于巨噬细胞凋亡通路的影响。方法：1.RAW264.7细胞接种于含10%胎牛血清的DMEM培养液中,培养液内含100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素,37℃、饱和湿度、5%C02培养箱中培养,至对数生长期用于实验。2.实验分为7组,分别为(1)正常组：巨噬细胞采用原培养基孵育;(2)乙酰化低密度脂蛋白对照组：原培养基中吸出125μL上清液,加入100μg/mlAc-LDL125μL;(3)脂多糖对照组：原培养基中吸出50μL上清液,加入1μg/mlLPS50μL;(4)模型组：原培养基中吸出175μL上清液,,加入100μg/mlAc-LDL125μL+1μg/mlLPS50μL;(5)低剂量观察组：原培养基中吸出275μL上清液,加入100μg/mlAc-LDL125μL+1μg/mlLPS50μL+120μg/ml黄芩苷溶液100uL；(6)中剂量观察组：原培养基中吸出275uL上清液,加入100μg/mlAc-LDL125μL+1μg/mlLPS50μL+240μg/ml黄芩苷溶液100μL(7)高剂量观察组：‘原培养基中吸出275μL上清液,加入100μg/mlAc-LDL125μL+1μg/mlLPS50μL+480μg/ml黄芩苷溶液100μL。3.AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测：用完全培养液调整细胞数为1.5×105个/ml,接种于24孔板,待细胞贴壁后,分组方法同前,刺激物加入24小时后,用不含EDTA的胰酶消化细胞,PBS洗两次,按试剂盒说明书要求染色后,流式细胞仪检测细胞凋亡率。4.Western-blot检测JNK,P38,SRA,IFN-β的表达；RT-PCR检测JNK,P38,SRA,IFN-β表达。结果：1.单纯的Ac-LDL或者LPS干预,均可明显增加巨噬细胞凋亡,并且细胞凋亡率与正常组比较有统计学差异。2.Ac-LDL+LPS模型组可以明显增加巨噬细胞凋亡率,其与空白组及两个对照组在细胞凋亡率方面均有统计学差异,说明炎症复合高脂对细胞凋亡有协同作用。3.黄芩苷低剂量观察组与模型组细胞细胞凋亡率相比差异无统计学意义(P>0.05)。黄芩苷中、高剂量观察组与模型组细胞凋亡率相比差异有统计学意义(P<0.05),黄芩苷中、高剂量观察组细胞凋亡率明显高于模型组,而高剂量观察组细胞凋亡率又高于中剂量观察组。与此同时,随着黄芩苷浓度的上升,磷酸化JNK蛋白表达、P38、SRA均有有升高趋势,某些组别和模型组比较有统计学意义,提示中、高剂量的黄芩苷可能通过激活三条通路促进巨噬细胞凋亡。4.P38通路的激活似乎与Ac-LDL干预主要相关(根据westernblot结果提示),低、中剂量黄芩苷对P38的表达有一定的抑制作用(但无统计学差异),高剂量黄芩苷可增加P38的表达。5.Ac-LDL+LPS复合干预可明显增加SRA蛋白表达,黄芩苷低、中、高剂量干预进一步增加SRA的表达。6.Ac-LDL+LPS可明显增加IFN-β的表达,黄芩苷低、中剂量干预可减少IFN-β的表达,高剂量黄芩苷增加IFN-β的表达。结论：1.Ac-LDL+LPS该种复合刺激因素可以明显增加巨噬细胞凋亡,并且复合因素干预较任一单一因素干预均可增加细胞凋亡率,说明炎症复合高脂诱发并促进巨噬细胞凋亡。通过黄芩苷低、中、高不同剂量对模型组的干预,巨噬细胞凋亡率仍在不断增加,说明黄芩苷与炎症复合高脂因素协同加剧了巨噬细胞的凋亡。2.通过对不同组别信号通路的测定发现,随着黄芩苷剂量的增加,JNK蛋白的表达明显增加；高剂量黄芩苷干预可明显增加P38-CHOP通路的蛋白表达；Ac-LDL+LPS模型组SRA的含量明显增加,黄芩苷低、中、高剂量干预后SRA表达进一步升高。3.黄芩苷的干预可以使三条通路的蛋白表达有升高趋势,但与此同时,黄芩苷高剂量也激活IFN-β,但总的致凋亡作用远远大于促生存作用,最终结果仍是巨噬细胞的凋亡。
【作者】彭锐；
【导师】吴伟；
【作者基本信息】广州中医药大学，中医内科学（专业学位），2014，博士
【关键词】巨噬细胞；凋亡率；黄芩苷；LPS；Ac-LDL；JNK；P38；SRA；

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