周期性张应力刺激下肌腱干细胞复合（聚乳酸—聚己内酯）/胶原支架构建组织工程肌腱的研究

【摘要】背景：各种创伤及疾病导致的肌腱损伤在临床上非常常见。有统计结果表明，全球每年至少有3000万的肌腱损伤病人。肌腱损伤后传统的治疗手段包括自体移植、同种异体移植、异种移植和假体材料移植等。但是这些肌腱再生重建技术均有各自的弊端，例如供体部位并发症、疾病传播、免疫排斥和修复不充分等。因此，临床上急需寻找一种性能良好且来源充足的活性修复材料用于肌腱损伤的修复。近20年来，随着细胞培养技术、移植技术和生物材料科学的发展，临床医学正步入一个“再生医学”的新阶段，一种较理想的肌腱替代物——组织工程肌腱，通过重建与天然肌腱生物力学、生物化学和组织学相似的再生组织，有可能解决损伤肌腱的修复问题。组织工程肌腱构建的要素主要包括种子细胞、支架材料、力学刺激、生长因子等。当前，构建功能性组织工程肌腱的瓶颈包括:获得足够的能向成熟肌腱细胞分化的种子细胞;制备良好生物相容性、力学性能的三维仿生支架材料;掌握促进种子细胞分化及组织形成的力学刺激等理化因素。但是，目前这些问题没有得到很好的解决，影响了肌腱组织工程的发展，制约了组织工程肌腱在临床肌腱损伤再生修复治疗中的应用。本研究针对这些现状，旨在系统的研究功能性组织工程肌腱构建所面临的瓶颈问题，最终目的为在周期性张应力刺激条件下，肌腱干细胞(TDSCs)复合(聚乳酸-聚己内酯)/胶原(P(LLA-CL)-Col)纳米纱仿生支架构建组织工程肌腱并促进损伤肌腱的再生。研究内容包括:在种子细胞选择、分化和调控方面，拟从兔髌腱组织分离、培养TDSCs，检测TDSCs多向分化潜能，为周期性牵张应力刺激调控TDSCs增殖并诱导其向肌腱细胞分化，以TDSCs为种子细胞构建组织工程肌腱打下基础。在组织工程支架方面，拟采用新的静电纺丝技术，研发一个既有较大三维(3D)空间结构能利于种子细胞生长，又有一定力学承载特性能抗牵拉的功能性肌腱支架——P(LLA-CL)-Col复合支架，使之更符合天然肌腱组织生物学特性和力学特性。最终将利用研发的P(LLA-CL)-Col支架复合TDSCs，在牵张应力刺激下构建组织工程肌腱，通过兔髌腱缺损损伤模型来评估所构建的组织工程肌腱促进损伤肌腱修复的作用。本研究分为三个部分：(1)兔TDSCs的分离、培养及多向分化潜能鉴定；(2)制备一种新型，3D，大孔，取向排列的P(LLA-CL)-Col纳米纱网络，检测它的理化性能及生物相容性，评估它作为组织工程肌腱支架的可行性及优势。(3)在体外生物反应器中，在牵张应力刺激条件下培养TDSCs复合P(LLA-CL)-Col支架构建的组织工程肌腱，从各方面评价构建组织工程肌腱的效果；在裸鼠体内，将TDSCs-P(LLA-CL)-Col复合物埋植在裸鼠背部皮下，评价模拟天然牵张应力刺激对所构建组织工程肌腱形成新生肌腱组织的效果；在兔髌腱损伤动物模型中评估工程化的组织工程肌腱对肌腱损伤修复的促进作用。本课题研究，将为组织工程肌腱应用于临床奠定实验基础，最终为损伤肌腱的治疗带来新的方向。第一章TDSCs的分离和鉴定目的：在组织的修复过程中，种子细胞扮演重要角色。肌腱细胞是损伤肌腱修复的主要功能细胞，它合成和分泌胶原等细胞外基质(ECM)，维持肌腱组织的新陈代谢。但是，它们是终未细胞而无自我更新能力。TDSCs是近几年发现的，来源于肌腱组织的干细胞，它是肌腱细胞的前体细胞，自身分化能力强，可以作为肌腱再生的理想种子细胞。本研究的目的是分离、培养和鉴定TDSCs，评估其克隆形成与三系分化的能力。方法：采用I型胶原酶和中性蛋白酶消化的方法分离获取肌腱细胞，通过低密度接种(2个细胞/cm2)单克隆培养的方法获得TDSCs，通过结晶紫染色实验测定TDSCs的克隆形成能力，通过添加化学诱导因子分别诱导TDSCs成骨、成脂、成软骨分化，通过0.1%茜素红，0.5%的油红O，和甲苯胺蓝染色检测TDSCs三系分化的能力。结果：兔髌腱组织经I型胶原酶和中性蛋白酶消化分离后能获得肌腱细胞，经过单克隆培养后能获得TDSCs，第一代TDSCs小部分呈鹅卵石样的椭圆形，大部分呈多角形和梭形。经成骨诱导培养后的TDSCs茜素红染色可见明显的钙结节形成，经成脂诱导培养后的TDSCs油红O染色显示细胞质内含大量的脂滴，经成软骨诱导培养后的TDSCs甲苯胺蓝染色显示细胞内含有大量蓝色异染颗粒，证明了TDSCs具备向不同方向分化的能力。结论：来源于肌腱组织的TDSCs具有干细胞的一般特性，可能是组织工程肌腱体外构建和体内损伤肌腱修复的理想的种子细胞来源。第二章新型静电纺P(LLA-CL)-Col纳米纱组织工程肌腱支架的制备及其性能研究目的：以新型支架材料为基础的组织工程为肌腱疾病的治疗提供了潜在的治疗策略。目前常用的组织工程肌腱支架的3D结构和形态均与天然肌腱基质的不一样。静电纺丝制备支架的方法简单实用，制备的支架具有高孔隙率，纤维直径为纳米到微米级，且结构与ECM结构相似等特点，目前传统的静电纺丝纳米纤维支架的孔径不利于种子细胞在其内部生长，而由松散分散的纳米纤维组成的静电纺丝纳米纱支架，具有3D多孔的微观结构，较大的孔径和较高的孔隙率。本实验用具有良好弹性、生物降解性、有一定力学强度的聚乳酸-聚己内酯共聚物(P(LLA-CL))和能改善细胞粘附性的I型胶原作为原料，运用新型静电纺丝的方法制备3D，大孔隙，取向的，且形态和结构类似于天然肌腱ECM的纳米纱网络作为组织工程肌腱支架，并检测它的理化性能和生物相容性。方法：在静电纺丝过程中利用一种新型动态水流收集系统制备P(LLA-CL)-Col纳米纱，使用传统方法制备无规和取向纳米纤维支架，评估支架的形态，孔隙率，成分，和力学性能；以及在支架上培养的肌腱细胞的粘附，增殖，渗透，和肌腱特定ECM基因表达的情况。结果：P(LLA-CL)-Col纳米纱支架拥有3D取向的微观结构，比无规和取向P(LLA-CL)-Col纳米纤维支架有更大的孔径和孔隙率。肌腱细胞生长在纳米纱支架上比在无规和取向纳米纤维支架上呈现了更好的自然形态，更好的细胞增殖和更多的ECM分泌。重要的是，P(LLA-CL)-Col纳米纱支架的空间结构非常利于细胞迁移到支架内部，以及肌腱相关ECM基因的表达，并形成质量更好的肌腱样组织。此外，该纳米纱支架能够在肌腱组织的再生修复过程中提供一定的力学支持。结论：静电纺丝P(LLA-CL)-Col纳米纱是一种新型的，3D，大孔，取向排列的网络支架，特别适合种子细胞在其表面及内部生长，在组织工程肌腱的构建中有很好的应用前景。第三章周期张应力对TDSCs-P(LLA-CL)-Col复合物生物学特性影响的研究目的：TDSCs是肌腱损伤修复及组织工程肌腱构建的一个有吸引力的种子细胞来源。然而，这些细胞在肌腱组织工程中的应用尚未被充分的探索。张应力刺激在肌腱和韧带的发育和损伤后的重建中发挥重要作用。本研究评估张应力刺激下TDSCs复合P(LLA-CL)-Col纳米纱支架所构建的组织工程肌腱的效果。方法：在体外生物反应器中(本课题组研制)，对组织工程肌腱予以0.5HZ，4%幅度，2h/天的张应力刺激培养14天(应力刺激实验组)，对照组静置培养，观察应力刺激对TDSCs的活性，增殖，腱系分化基因和蛋白表达的影响。在裸鼠体内，将4-5cm长的组织工程肌腱中的2cm两端缝合在裸鼠背部的脊上韧带上(应力刺激实验组)，剩余大约2cm一端与实验组部分相连，一端游离(未受力对照组)，术后2，4，8周行活体成像，组织学及免疫组化检测。最后将体外培养(应力刺激实验组与对照组)后的组织工程肌腱移植到兔髌腱缺损部位，术后4，12周行组织学检测和力学测试。结果：体外应力刺激不影响TDSCs的细胞活性，能促进TDSCs的增殖，以及促进TDSCs向肌腱系分化；体内天然的应力刺激在TDSCs-P(LLA-CL)-Col复合物移植到裸鼠体内后，同样促进了新生肌腱组织的形成。更重要的是，应力刺激后的TDSCs-P(LLA-CL)-Col复合物能更好的促进兔髌腱缺损的修复，再生肌腱组织的胶原含量以及肌腱相关的蛋白表达明显增加，力学性能明显改善。结论：TDSCs作为种子细胞在损伤肌腱再生中有巨大的应用潜能，应力刺激有利于组织工程化肌腱的成熟构建，这些可能为未来临床肌腱损伤的治疗提供新策略。
【作者】徐源；
【导师】周强；
【作者基本信息】第三军医大学，外科学，2014，博士
【关键词】周期张应力；(聚乳酸-聚己内酯)/胶原；支架；肌腱干细胞；肌腱组织工程；

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