染色体结构维持蛋白4在肝癌细胞增殖和侵袭中的作用及其调控机制

染色体结构维持蛋白4在肝癌细胞增殖和侵袭中的作用及其调控机制

作者:师大云端图书馆 时间:2015-07-17 分类:文献综述 喜欢:3938
师大云端图书馆

【摘要】一、研究背景原发性肝癌最常见类型为肝细胞肝癌,它在全球最致命癌症中排名第三,仅次于肺癌和胃癌。全球每年有750,000新发病例,肝细胞肝癌还是全球第六常见肿瘤,在其检测和治疗方面,目前仍存在着非常大的争议。小肝癌治疗效果非常好,但是由于肝癌的隐匿性较高,临床症状不明显,临床诊断的大部分肝癌患者,都已发展到肿瘤晚期,对晚期肝癌有效的治疗手段非常有限。从分子生物学角度来看,肝癌是高度异构型肿瘤。越来越多的研究表明,肝癌的复杂性和临床多样性,主要是由于基因在疾病发生和发展的过程中的变异越来越多。有文献报道,肝癌的发生和发展是由于各种细胞通路的异常激活,比GSK-3β-C/EBPα-miR-122-IGF1R、HDGF-relatedprotein-3、FoxM1/ACP5、JAK/Stat等等。而且,有研究表明JAK/Stat细胞通路在肝癌的发展过程中起着非常重要的作用,通过抑制JAK/Stat通路,对肝癌的治疗起着非常重要的作用。因此,鉴别新的肝癌的分子调控机制,目前已作为肝癌治疗的重要的研究领域和热点。二、研究目的本研究旨在研究染色体结构维持蛋白4(structuralmaintenanceofchromosome4,SMC4)在肝癌细胞侵袭和增殖中的重要作用及其调控机制。三、材料和方法1.原发性肝癌组织、癌旁组织、正常肝脏组织各72例,均来自原发性肝癌患者标本。Real-timePCR、westernblotting和IHC检测SMC4在肝癌组织和细胞中的表达水平。利用统计学方法分析SMC4的表达水平与患者临床参数之间的关系。2.为了研究SMC4在肝癌中的作用,首先合成3个干扰片段和1个阴性对照,并利用real-timePCR和westernblotting技术筛选出SMC4的最佳干扰片段。构建的SMC4干扰载体(homo-830),利用转染技术转染到肝癌细胞中进行深入研究。利用细胞划痕修复实验和侵袭实验,研究SMC4在肝癌细胞侵袭中的作用;细胞克隆形成实验和WST-1实验,检测SMC4在肝癌细胞增殖中的作用。3.利用生物信息学软件对SMC4的3’UTR进行分析,结果发现miR-219与SMC4有两个结合位点。利用real-timePCR技术检测miR-219在肝癌组织和肝癌细胞中的表达情况。将miR-219的模拟物和抑制物,分别转染到97-H和HepG2细胞中,利用real-timePCR和westernblotting技术检测SMC4在肝癌细胞中表达情况的变化。荧光素酶报告基因技术,分析miR-219与SMC4结合活性。4.通过PIPs和Donime软件对SMC4的下游调控因子进行分析,结果提示JAK2/Stat3为SMC4潜在的下游调控位点。利用real-timePCR和westernblotting技术对JAK2/Stat3在肝癌细胞和组织中的表达情况进行分析。通过转染SMC4干扰载体(homo-830),利用real-timePCR和westernblotting分析SMC4和JAK2/Stat3之间的调控关系,免疫共沉淀技术检测Stat3的磷酸化位点。最后,通过干扰miR-219的表达变化,利用westernblotting技术研究miR-219与JAK2/Stat3之间的调控关系及Stat3的磷酸化情况。四、统计学方法利用SPSS16.0进行统计学分析。两样本均值组间比较采用t检验,SMC4的表达水平与临床参数之间的关系采用U检验,计量资料用均数±标准差来表示,P<0.05有统计学意义。五、结果1.Real-timePCR和westernblotting结果均提示,SMC4在肝癌组织和细胞中的表达明显上调,相对于正常对照组;免疫组化结果也提示,SMC4在肝癌组织中的表达明显上调。统计学结果得出,SMC4在肝癌中的表达水平与肿瘤大小、细胞分化、TNM分期和血管侵犯有关,而与患者的年龄、性别和肿瘤类型无关。预示着SMC4的表达水平可能与肝癌患者的不良预后有关。2.Real-timePCR和westernblotting结果提示,homo-830为SMC4的最佳干扰片段。细胞划痕修复实验和细胞侵袭实验结果提示,与转染空载体和未转染组相比,转染SMC4干扰载体组的肝癌细胞其迁移率明显降低;细胞克隆形成实验表明,实验组中肝癌细胞增殖率明显降低;WST-1实验结果提示,转染SMC4干扰载体后,肝癌细胞的增殖率由100%下降到73.4%。因此,以上实验结果提示:SMC4在促进肝癌细胞的增殖和侵袭过程中起着非常重要的作用。3.miR-219在4组肝癌细胞和肝癌组织标本中的表达明显下调。当miR-219模拟物和抑制物分别转染到97-H和HepG2细胞中,real-timePCR和westernblotting检测结果均提示:miR-219沉默后,会导致SMC4的表达明显上调;而且miR-219表达增强后,也会导致SMC4表达的显著下调。荧光素酶报告基因实验结果也提示,miR-219和SMC4之间存在着负向调控关系。4.Real-timePCR和westernblotting实验结果提示,在基因水平和蛋白水平,JAK2/Stat3在肝癌细胞和组织中的表达水平均明显上调。SMC4干扰载体(homo-830)转染到97-H和HepG2细胞中,real-timePCR和westernblotting实验结果均提示,无论在基因水平,还是蛋白水平,JAK2/Stat3的表达都随着SMC4的降低而降低。免疫共沉淀实验结果显示,p-Stat3的磷酸化位点为第705号酪氨酸,而第727号丝氨酸的表达无显著变化。Westernblotting结果提示,在97-H和HepG2细胞中,miR-219与JAK2/Stat3也存在着负向调控关系,酪氨酸的表达也随着发生变化。六、结论SMC4在肝癌中表达明显上调,其表达水平与肿瘤大小、细胞分化、TNM分期和血管侵犯有关;SMC4能够促进肝癌细胞的增殖和侵袭;本研究第一次完整研究了肝癌中新的调控通路:miR-219-SMC4-JAK2/Stat3(Tyr705),及其在促进肝癌发展中的作用。
【作者】周波;
【导师】陈平;
【作者基本信息】第三军医大学,外科学(专业学位),2014,博士
【关键词】染色体结构维持蛋白4;肝癌;miR-219;JAK2/Stat3;

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