经心外膜注射低氧预处理人脂肪源干细胞治疗猪急性心肌梗死的实验研究

【摘要】目的：脂肪干细胞(Adipose-derivedstemcells,ADSCs)作为细胞移植治疗心肌梗死的种子细胞,具有易于获取,数量丰富,多向分化等特点。将ADSCs移植用于治疗心肌梗死已取得显著的疗效。然而,心肌梗死微环境复杂恶劣,不利于ADSCs的定植,进而限制了ADSCs的治疗效果。近年来,人们发现低氧环境下培养干细胞可作为提高ADSCs抗凋亡能力,增强ADSCs旁分泌效应的体外预处理方法。本实验选取人脂肪干细胞(HumanAdipose-derivedstemcells,hADSCs),通过低氧环境下培养的方法,观察其分泌的细胞因子与抗凋亡能力。同时,选取中华小型猪,通过外科手术建立急性心肌梗死模型,将hADSCs与低氧环境下培养的人脂肪干细胞(HypoxicPreconditioninghumanAdipose-derivedstemcells,HP-hADSCs)经心外膜移植至心肌梗死组织周围,观察hADSCs与HP-hADSCs移植对心肌梗死的修复效果并比对两者之间的差异,从而进一步探讨可能存在的机制。方法：经吸脂术获取脂肪组织后,hADSCs经体外分离、培养、扩增至第3-5代。按照不同氧浓度环境分为5组：A：1%O2组,B：3%O2组,C：5%02组,D：10%02组,E：21%02组。各组hADSCs在各自培养环境中培养24小时,应用FCSA、RT-qPCR,ELISA、WesternBlot、AnnexinV-FITC/PI的方法对各组hADSCs的免疫细胞表型、细胞因子的基因表达与蛋白分泌、细胞的抗凋亡能力进行对比,选出生物学特性最佳的hADSCs作为HP-hADSCs.采用外科手术方法于冠状动脉前降支中、远端1/3交界处结扎,制作猪急性心肌梗死动物模型。随机将实验动物分为3组,每组8只,按以下条件分组：A组：对照组,心梗周围组织注射0.9%氯化钠,B组：hADSCs移植组,C组：HP-hADSCs移植组。A组注射剂量为1ml,B组与C组每只动物分别经心外膜注射1×108的hADSCs或HP-hADSCs,分成8-10个点注射至心梗周围组织。术前、术后即刻,术后6周,采用静息核素心肌灌注显像与经胸心动超声对心肌血流灌注和心功能做出评估。对实验动物施行安乐死后,采集梗死区域的心肌标本,应用HE染色、Massson染色、免疫荧光染色和TUNEL染色的方法观察植入干细胞的定植、扩增、血管新生、细胞凋亡。结果：(1)hADSCs免疫表型抗原CD71、CD73、CD90、CD105阳性表达,CD34、CD45、CD54.HLA-DR阴性表达。RT-qPCR示HGF与VEGF的mRNA表达量随着氧浓度的降低而逐渐升高,以A组最为显著(P<0.05),而NGF与KGF的mRNA表达量并无显著变化(P>0.05)。ELISA结果提示低氧条件下培养hADSCs的细胞因子VEGF、HGF蛋白分泌量显著增加,其中B组的HGF分泌量达2613.33±180.37ng/L,B组的VEGF分泌量达2856.08±114.63ng/L,显著高于E组(HGF:2613.33＋180.37ng/Lvs1733-.33＋102.63ng/L,P<0.01;VEGF:2856.08±114.63ng/Lvs2067.26±45.63ng/L,P<0.01),各组hADSCs的细胞因子KGF与NGF蛋白分泌量并无显著性差异(P>0.05)。(2)RT-qPCR示与其他组相比,A组中Bax.BNip3的mRNA表达量最高,B组中,Bcl-2的mRNA表达量最高。WesternBlot示A组中hADSCs的HIF-la,Bax和BNip3蛋白表达水平最高,在B组中hADSCs的Bcl-2蛋白表达水平较高。将各组hADSCs放入无氧无血清低糖培养环境中12小时,AnnexinVFITC/PI示A组、B组、C组hADSCs在此环境中的存活率较高,虽三组间比较并无统计学差异,但以B组中ADSCs的存活率最高。结合各组hADSCs的细胞因子蛋白分泌量结果,3%02环境适宜培养hADSCs,因此,拟将此环境中培养的hADSCs作为HP-hADSCs进行动物实验。(3)干细胞移植6周后,hADSCs移植组与HP-hADSCs移植组经静息核素心肌灌注显像检测的灌注质量缺损百分率变化得到改善,以HP-hADSCs移植组更为显著(P<0.01)；经胸超声心动图观察到的各组LVEF与IWT并无显著差异(P>0.05),但HP-hADSCs组中的LVEDV与LVESV得到显著改善(P<0.05)。HE染色与Masson染色示hADSCs移植组与HP-hADSCs移植组纤维化程度较低,两组间虽无统计学差异,但HP-hADSCs移植组纤维化降低程度的趋势更为明显。(4)免疫荧光检查发现,干细胞移植6周后,HP-hADSCs移植组中Ki67与β-microglobulin阳性表达,说明HP-hADSCs仍存活于心肌梗死周围,且呈扩增状态,而hADSCs移植组仅发现移植的细胞。与对照组相比,HP-hADSCs移植组与hADSCs移植组的IsolactinB4阳性表达,且HP-hADSCs移植组中可见清晰的血管组织走形。TUNEL染色示HP-hADSCs移植组与hADSCs移植组中的细胞凋亡明显减少,以HP-hADSCs移植组更为显著(P<0.01)。结论：(1)低氧环境下培养是提高hADSCs旁分泌及抗凋亡能力的有效方法,但过低的氧浓度(02<3%)不易于hADSCs的生存。(2)3%02环境中培养hADSCs24小时,可有效提高ADSCs细胞因子分泌量以及抗凋亡能力。(3)与hADSCs移植相比,经心外膜注射HP-hADSCs够缩小心肌梗死面积,减少心肌纤维化,使心功能不再恶化,有效抑制心室重塑。(4)HP-hADSCs能够在心肌组织中存活扩增,通过旁分泌途径促进血管新生,减少细胞凋亡。
【作者】姜亦瑶；
【导师】刘晓程；
【作者基本信息】天津医科大学，外科学（专业学位），2014，博士
【关键词】脂肪干细胞；低氧；急性心肌梗死；细胞因子；凋亡；

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