糖原合成酶激酶-3β调控NMDA及AMPA受体在瑞芬太尼痛觉过敏中的机制研究

【摘要】阿片类药物是临床疼痛治疗的代表性药物,主要用于急、慢性疼痛和癌痛的治疗。应用阿片药物引起镇痛作用之外的多种不良反应,阿片类药物诱发痛觉过敏就是其中之一,很大程度上限制了阿片类药物的临床应用。瑞芬太尼是一种超短效μ-阿片受体激动剂,其特点有无蓄积、清除快、起效快被广泛应用于全身麻醉的术中镇痛,查阅文献发现瑞芬太尼诱发痛觉过敏的出现时间短,且发生率高于其他阿片类药物。最近临床研究和基础研究表明给予氯氨酮(NMDA受体抑制剂)可以抑制瑞芬太尼痛觉过敏的发生,提示NMDA受体参与瑞芬太尼痛觉过敏的形成,但是应用氯胺酮可产生嗜睡、头晕、镇静和幻觉等副作用,应用上受到一定限制。因此明确瑞芬太尼痛觉过敏的分子机制和寻找新的用药靶点具有重要临床意义。糖原合成酶激酶-3(glycogensynthasekinase-3,GSK-3)是一种多功能丝氨酸/苏氨酸激酶,在真核生物细胞中普遍存在。GSK-3有两个亚型——GSK-3α和GSK-3β。GSK-3的主要功能是参与糖原的分解合成,调控神经元生长、增殖和分化等。近年来研究发现,GSK-3β影响突触可塑性,并对神经元NMDA受体和AMPA受体的运输和功能有重要调控作用。由此我们推测GSK-3β调控NMDA受体和AMPA受体的运输和功能可能是瑞芬太尼痛觉过敏的发生机制。本研究采用大鼠切口痛-瑞芬太尼痛觉过敏模型和体外脊髓片瑞芬太尼孵育模型,研究GSK-3β在瑞芬太尼诱发痛觉过敏大鼠脊髓背角NMDA受体和AMPA受体不同亚基表达和功能的变化,对瑞芬太尼痛觉过敏的分子机制进行深入探索,为寻找防治阿片类药物诱发痛觉过敏方法提供新的作用靶点。第一部分：切口痛-瑞芬太尼痛觉过敏大鼠脊髓GSK-3β蛋白活性的变化目的通过检测大鼠脊髓背角GSK-3β蛋白活性的改变,探讨GSK-3β在切口痛-瑞芬太尼引发痛觉过敏中的潜在机制。方法雄性SD大鼠32只,经尾静脉穿刺置管,体重240-260g,随机数字表法分为4组(n=8)：对照组(C组)：经尾静脉置管输注生理盐水,0.1ml·kg-1·min-1；切口痛组(I组)：建立Brennan切口痛模型,同时经尾静脉置管输注等量生理盐水,0.1ml·kg-1·min-1；瑞芬太尼组(R组)：经尾静脉置管输注瑞芬太尼,1.0μg·kg-1·min-1；瑞芬太尼+切口痛组(RI组)：建立Brennan切口痛模型,同时经尾静脉置管输注瑞芬太尼,1.0μg·kg-1min-1;生理盐水和瑞芬太尼的输注时间均为60min。于输注前1d、输注后2h、6h、1d、2d、3d、5d和7d,分别采用电子Von-Freyfilaments法测定机械刺激缩爪阈值(PWT),热板法测定热刺激缩爪潜伏期(PWL),输注后2d处死大鼠,取脊髓IA-6节段,采用WesternBlot法测定大鼠腰段脊髓背角磷酸化丝氨酸9-GSK-3β(pSer9-GSK-3β),磷酸化酪氨酸216-GSK-3β(pTyr216-GSK-3p)和总GSK-3β的蛋白表达在各组的变化。结果与C组相比,I组、R组、RI组均发生热痛敏和机械痛敏。RI组热痛敏和机械痛敏的程度高于I和R组。与C组相比,R组、I组、RI组均发生pTyr216-GSK-3p表达水平升高,且RI组的升高程度高于R组和I组。与C组相比,R组、I组、RI组均发生pSer9-GSK-3β表达降低,且RI组的降低程度高于R组和I组。GSK-3β的总蛋白表达水平在各组无统计学差异。结论瑞芬太尼术中输注可加重切口痛诱发的痛觉过敏；切口痛-瑞芬太尼痛觉过敏可增加大鼠脊髓背角GSK-3β活性,这是通过升高GSK-3β的Tyr216磷酸化和降低Ser9的磷酸化水平引起的,这可能是切口痛-瑞芬太尼痛觉过敏的潜在机制之一。第二部分：GSK-30对瑞芬太尼痛觉过敏大鼠脊髓NMDA受体运输和功能的影响实验一：GSK-3β对瑞芬太尼痛觉过敏大鼠脊髓NMDA受体NR1、NR2A和NR2B亚单位运输的影响目的通过检测GSK-3β抑制剂对大鼠脊髓背角NMDA受体亚单位运输的影响,探讨GSK-3β参与NMDA受体亚单位表达和运输在瑞芬太尼诱发痛觉过敏中的作用。方法雄性SD大鼠40只,经尾静脉置管,体重240-260g,随机数字表法分为5组(n=8)：对照组(C组)：经尾静脉置管输注生理盐水,0.1ml·kg-1·min-1;甘氨酸组(G组)：经尾静脉置管输注甘氨酸,15μg·kg-1·min-1;瑞芬太尼组(R组)：经尾静脉置管输注瑞芬太尼,1.0μg·kg-1·min-1;瑞芬太尼+GSK-3p抑制剂TDZD组(RT组)：经尾静脉置管输注瑞芬太尼1.0μg·kg-1·min-1和TDZD1μg·kg-1:TDZD组(T组)：经尾静脉置管输注,TDZD1μg·kg-1;输注时间均为60min。于输注前24h、输注后2h、6h、24h和48h,分别采用热板法测定热刺激缩爪潜伏期(PWL),电子Von-FreyFilaments法测定机械刺激缩爪阈值(PWT),输注后48h处死大鼠,取脊髓L4-6节段,采用WesternBlot法分别测定脊髓背角NMDA受体NR1、NR2A及NR2B亚单位的膜蛋白和总蛋白表达水平。结果与C组比较,R组热痛敏和机械痛敏增强,NMDA受体NR1和NR2B亚单位细胞膜蛋白表达上调,NMDA受体NR1和NR2B亚单位总蛋白表达上调(P<0.05)。与R组比较,T组热痛敏和机械痛敏降低,NMDA受体NR1和NR2B亚单位细胞膜蛋白表达下调,NMDA受体NR1和NR2B亚单位总蛋白表达下调,(P<0.05)。各组NMDA受体NR2A亚单位的细胞膜及总蛋白表达均无显著性差异(P>0.05)。结论瑞芬太尼痛觉过敏大鼠脊髓背角NMDA受体NR1及NR2B亚单位向细胞膜的运输和表达增加,GSK-3β抑制剂TDZD可以降低瑞芬太尼输注所引起的热痛敏和机械痛敏,降低NR1和NR2B的运输和表达。提示瑞芬太尼可能通过增强GSK-3β活性来增强NR1和NR2B的运输和表达。实验二：GSK-3β对瑞芬太尼痛觉过敏大鼠脊髓NMDA受体功能的影响目的探讨GSK-3β在瑞芬太尼诱发大鼠脊髓背角神经元NMDA受体微小兴奋性突触后膜电流(miniatureexcitatorypostsynapticcurrents,mEPSCs)中的作用。方法取出生14～18天的SD大鼠24只,体重50-60g,随机分为4组(n=8)：对照组(C组)：取腰段脊髓(L1～S1),制备脊髓片,置入人工脑脊液中孵育;甘氨酸组(G组)：制备脊髓切片,置入含甘氨酸(浓度0.24μmol·L-1)的人工脑脊液中孵育；瑞芬太尼组(R组)：制备脊髓切片,置入含瑞芬太尼(浓度为4nmol·L-1)的人工脑脊液中孵育;瑞芬太尼+GSK-3β抑制剂TDZD-8组(RT组)：制备脊髓切片,置入含瑞芬太尼和TDZD-8(浓度分别为4nmol·L-1和10μmolL-1)的人工脑脊液中孵育。各组孵育60min后应用全细胞膜片钳技术记录脊髓背角神经元NMDA受体介导的mEPSCs的振幅和频率。结果与C组比较,R组mEPSCs的振幅和频率升高(P<0.01),G组和RT组差异无统计学意义(P>0.05);与R组比较,RT组振幅和频率降低(P<0.01)。结论瑞芬太尼孵育增强后可增强NMDA受体的功能,GSK-3β抑制剂TDZD可以抑制瑞芬太尼孵育对NMDA受体功能的增强作用,说明瑞芬太尼孵育后可引起GSK-3p活性增强,进而增强NMDA受体功能。第三部分：GSK-3β对瑞芬太尼痛觉过敏大鼠脊髓AMPA受体运输和功能的影响实验一：GSK-3β对切口痛一瑞芬太尼痛觉过敏大鼠脊髓AMPA受体GluR1和GluR2亚单位运输的影响目的通过评价切口痛-瑞芬太尼痛觉过敏大鼠脊髓AMPA受体亚单位运输的变化,探讨GSK-3β调控AMPA受体亚单位运输在瑞芬太尼引发痛觉过敏中的机制。方法健康雄性SD大鼠,尾静脉置管,体重240-260g,随机数字表法分6组(n=8)：对照组(C组)：经尾静脉置管输注生理盐水,0.1ml·kg-1min-1;瑞芬太尼组(R组)：经尾静脉置管输注瑞芬太尼,1.0μg·kg-1min-1;切口痛组(I组)：建立Brennan切口痛模型,同时经尾静脉置管输注等量生理盐水,0.1ml·kg-1·min-1;瑞芬太尼+切口痛组(RI组)：建立Brennan切口痛模型,同时经尾静脉置管输注瑞芬太尼,1.0μg·kg-1·min-1;瑞芬太尼+GSK-3β抑制剂LiCl组(LiC1组)：建立Brennan切口痛模型,同时经尾静脉置管输注瑞芬太尼1.0μg·kg-1·min-1和LiCl100mg·kg-1;瑞芬太尼+GSK-3β抑制剂TDZD组(TDZD组)：建立Brennan切口痛模型,同时经尾静脉置管输注瑞芬太尼1.0μg·kg·min-1和TDZD1.0μg·kg-1;生理盐水和瑞芬太尼的输注时间均为60min。于麻醉前1d、麻醉后2h、6h、1d、2d、3d、5d和7d,分别采用电子Von-Freyfilaments法和热板法测定机械刺激缩足阈值(PWT)和热刺激缩足潜伏期(PWL)。C组,R组,I组,LiCl组和TDZD组在输注后2d处死大鼠,RI组大鼠分别在输注前1d、输注后2h、6h、1d、2d、3d、5d和7d处死大鼠,取脊髓IA-6节段,采用WesternBlot法测定大鼠腰段脊髓背角AMPA受体GluR1和GluR2亚单位细胞膜(mem)及细胞浆(cyto)的动态表达变化。结果RI组大鼠,memGluR1亚单位从2h开始升高,2d达高峰,于5d恢复至-1d水平(P<0.05),而cytoGluR1亚基从-1d至7d无显著性差异(P>0.05)。与C组比较(2d),R组、I组和RI组PWT降低,PWL缩短,memGluR1亚单位表达上调(P<0.05),cytoGluR1亚单位无显著性差异(P>0.05)。各组mem和cytoAMPA受体GluR2亚单位表达无显著性差异(P>0.05)。与RI组比较,LiCl组和TDZD组PWT升高,PWL增加,memGluR1亚单位表达下调(P<0.05),cytoGluRl亚单位无显著性差异(P>0.05)。结论切口痛-瑞芬太尼痛觉过敏的大鼠脊髓AMPA受体细胞膜GluRl亚单位向细胞膜的运输增加,蛋白表达增加,2d达高峰。GSK-3β抑制剂LiC1和TDZD可以抑制瑞芬太尼引起的memGluRl亚单位表达上调,提示瑞芬太尼可能通过增强GSK-3p活性而增加大鼠脊髓AMPA受体GluRl亚单位向细胞膜的运输。实验二：GSK-3β对瑞芬太尼痛觉过敏大鼠脊髓AMPA受体功能的影响目的探讨GSK-3β在瑞芬太尼诱发大鼠脊髓背角神经元AMPA受体mEPSCs中的作用。方法取出生14～18天的SD大鼠24只,体重50～60g,随机分为4组(n=8)：对照组(C组)：取腰段脊髓(L1～S1),制备脊髓片,置入人工脑脊液中孵育：瑞芬太尼组(R组)：制备脊髓切片,置入含瑞芬太尼(浓度为4nmol·L-1)的人工脑脊液中孵育；瑞芬太尼+GSK-3p抑制剂LiC1组(LiC1组)：制备脊髓切片,置入含瑞芬太尼和LiCl(浓度分别为4nmol·L-1和20nmol-L-1)的人工脑脊液中孵育：瑞芬太尼+TDZD组(TDZD组)：制备脊髓切片,置入含瑞芬太尼和TDZD-8(浓度分别为4nmol·L-1和10μmol·L-1)的人工脑脊液中孵育；各组孵育60min。应用全细胞膜片钳技术记录脊髓背角神经元AMPA受体介导的mEPSCs的频率和振幅。结果与C组比较,R组AMPA-mEPSCs的幅值和频率升高(P<0.01),LiCl组和TDZD组差异无统计学意义(P>0.05)；与R组比较,LiCl组和TDZD组幅值和频率降低(P<0.01)。结论瑞芬太尼孵育增强后可增强AMPA受体的功能,GSK-3β抑制剂LiCl和TDZD可以抑制瑞芬太尼孵育后AMPA受体功能的增加,说明瑞芬太尼痛觉过敏与GSK-3β活性增强和AMPA受体功能增强有关。实验三：GSK-3p调控AMPA受体运输和功能的相关机制目的探讨GSK-3β调控瑞芬太尼痛觉过敏诱发AMPA受体向细胞膜运输的相关机制方法雄性SD大鼠,尾静脉置管,体重240-260g,随机数字表法分4组(n=8)：对照组(C组)：经尾静脉置管输注生理盐水,0.1ml·kg-1·min-1;瑞芬太尼+切口痛组(RI组)：建立Brennan切口痛模型,同时经尾静脉置管输注瑞芬太尼,1.0μg·kg-1·min-1;瑞芬太尼+GSK-3β抑制剂LiCl组(LiC1组)：建立Brennan切口痛模型,同时经尾静脉置管输注瑞芬太尼1.0μg·kg-1·min-1和LiCl100mg·kg-1;瑞芬太尼+GSK-3β抑制剂TDZD组(TDZD组)：建立Brennan切口痛模型,同时经尾静脉置管输注瑞芬太尼1.0μg·kg-1·min-1和TDZD1.0μg·kg-1;生理盐水和瑞芬太尼的输注时间均为60min。于麻醉后2d处死大鼠,取脊髓L4-6节段,采用WesternBlot法测定大鼠腰段脊髓背角GluRl亚单位丝氨酸845位点磷酸化水平(pSer845-GluR1)、GluR2亚单位丝氨酸880位点磷酸化水平(pSer880-GluR2)、Rab5、Rab4以及PSD-95的表达变化。结果与C组相比,RI组、LiCl组和TDZD组的pSer845-GluR1水平增高(P<0.05)。与RI组比较,LiCl组和TDZD组的pSer845-GluRl水平明显降低(P<0.05)。各组pSer880-GluR2水平无显著性差异(P>0.05)。与C组相比,RI组Rab5蛋白表达水平降低(P<0.05)。与RI组比较,LiCl组和TDZD组的Rab5蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。各组Rab4和PSD-95蛋白表达水平无显著性差异(P>0.05)。结论瑞芬太尼痛觉过敏的大鼠脊髓AMPA受体GluR1亚单位向细胞膜的运输增加和表达增加与pSer845-GluR1升高以及Rab5表达水平降低相关。GSK-3β抑制剂LiCl和TDZD可以抑制瑞芬太尼引起的pSer845-GluR1表达上调和Rab5表达下调,提示GSK-3β活性而增加可以增强pSer845-GluR1水平和降低Rab5表达水平进而增加大鼠脊髓AMPA受体GluR1亚单位向细胞膜的运输,该机制参与瑞芬太尼痛觉过敏的形成。
【作者】李依泽；
【导师】王国林；
【作者基本信息】天津医科大学，麻醉学，2014，博士
【关键词】痛觉过敏；瑞芬太尼；NMDA受体；AMPA受体；糖原合成酶激酶-3β；兴奋性突出后膜电流；

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