丹参酮IIA抑制UVB照射诱导的HaCaT细胞急性损伤的研究

【摘要】表皮角质形成细胞构成了人体最外层的屏障并且直接暴露于周围环境的各种损伤因素中,尤其是紫外光辐射,短期大剂量暴露可引起急性光毒性反应如日晒伤,慢性长期暴露可引起慢性光毒性反应如表皮萎缩甚至恶性转化形成日光性角化、皮肤鳞状细胞癌、基底细胞癌等。细胞内活性氧族产生是角质形成细胞紫外光辐射损伤的重要病理生理过程,植物抗氧化剂防治紫外光辐射损伤是目前该领域中的研究热点。本研究旨在探索植物抗氧化剂丹参酮ⅡA对角质形成细胞急性紫外光辐射损伤的抑制作用。(1)丹参酮ⅡA工作浓度与预处理时间的摸索因为丹参酮ⅡA除具有抗氧化、抗炎症等生物活性外还具有抗肿瘤的细胞毒性作用,不排除较高剂量的丹参酮ⅡA可能对HaCaT细胞有生长抑制作用。为了减少后续实验中的可控变量,我们采用了日本Dojindo化学研究所的CellCountingKit-8检测丹参酮ⅡA对HaCaT细胞活力的影响。结果显示,与人表皮癌A431细胞相比,丹参酮ⅡA对HaCaT细胞活力的影响相对较小,提示丹参酮ⅡA对肿瘤细胞与正常角质形成细胞的生长抑制作用有一定的差异性,与文献报道的结果相似,但0.625gg/ml及以上较高浓度的丹参酮ⅡA仍将在一定的浓度范围内剂量依赖性地显著抑制HaCaT细胞的活力。单次加药一定浓度的丹参酮ⅡA可在8小时以内抑制HaCaT细胞和A431细胞活力,处理12小时以上时对HaCaT细胞和A431细胞活力的抑制能力均有所下降,可能是被处理细胞对丹参酮ⅡA的处理产生了一定的适应,也可能是由于丹参酮ⅡA在37℃环境下发生了降解(丹参酮ⅡA储存温度为4℃)。(2)丹参酮ⅡA抑制UVB照射诱导的HaCaT细胞凋亡与UVA照射相比,UVB照射引起的细胞死亡方式以凋亡为主,与细胞内活性氧族产生损伤遗传物质及线粒体有关,抗氧化剂预处理可降低被照射细胞的凋亡率。应用丹参酮ⅡA的抗氧化能力治疗各种氧化应激性疾病已久,但尚未见丹参酮ⅡA抑制UVB照射引起的氧化损伤的研究。为了探索具有抗氧化能力的丹参酮ⅡA对UVB照射诱导的HaCaT细胞凋亡的抑制能力,我们采用了Hoechst33342和PropidiumIodide双染法、DNALadder法和AnnexinV和PropidiumIodide双染法观察了丹参酮ⅡA预处理对经UVB照射的HaCaT细胞凋亡率的影响。结果显示,荧光显微镜下,经丹参酮ⅡA预处理的HaCaT细胞在UVB照射后发生核固缩、核碎裂等凋亡特异性改变的细胞比例低于未经丹参酮ⅡA预处理的HaCaT细胞；经丹参酮ⅡA预处理的HaCaT细胞在UVB照射后基因组DNA电泳形成的DNAladder比未经丹参酮ⅡA预处理的HaCaT细胞基因组DNA形成的DNAladder暗淡,提示经丹参酮ⅡA预处理的细胞发生凋亡特异性DNA断裂的程度要低于未经预处理的细胞；AnnexinⅤ和PropidiumIodide双染法流式细胞术检测发现与未经丹参酮ⅡA预处理的HaCaT细胞相比,经丹参酮ⅡA预处理的HaCaT细胞在UVB照射后早期凋亡率、晚期凋亡率和总死亡率均有所降低。(3)丹参酮ⅡA抑制UVB照射诱导的HaCaT细胞内活性氧族产生UVB照射致细胞内活性氧族产生是其引起细胞急性损伤及恶性转化的重要介质,以抗氧化剂清除UVB照射诱导产生的细胞内活性氧族可以阻止多种UVB照射引起的细胞生物学事件。丹参酮ⅡA可能通过上调超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶等生物体内抗氧化酶的表达催化活性氧族的分解而提高细胞抗氧化应激的能力。为了探索丹参酮ⅡA预处理对UVB照射诱导的HaCaT细胞内活性氧族产生的影响,我们采用DCFH-DA做为荧光探针,以荧光倒置显微镜及流式细胞仪观察和检测了HaCaT细胞内活性氧族产生的水平。结果显示,丹参酮ⅡA预处理可以剂量依赖性地降低UVB照射诱导的HaCaT细胞内活性氧族产生,减轻线粒体水肿与细胞质膜破坏,提示丹参酮ⅡA预处理对UVB照射引起的HaCaT细胞急性损伤具有抑制作用。(4)丹参酮ⅡA抑制UVB照射诱导的Gadd45a表达与HaCaT细胞基因组DNA低甲基化UVB照射可以诱导多种细胞的Gadd45α表达与基因组DNA甲基化水平降低,基因组DNA甲基化水平降低是多种肿瘤细胞的共同表观遗传学特征,并且可能在肿瘤发生过程中起重要作用。研究发现细胞内活性氧族产生是该过程的重要介质,抗氧化剂对UVB照射诱导的基因组DNA低甲基化有抑制作用。丹参酮ⅡA除具有抗氧化能力外,还具有抑制Gadd45a表达依赖的核转录因子AP-1的作用,但未见应用丹参酮ⅡA于此领域的研究,为了探索丹参酮ⅡA预处理对UVB照射诱导的HaCaT细胞Gadd45α表达与基因组DNA甲基化水平降低的影响,我们采用了WesternBlot法检测Gadd45a的表达,激光共聚焦荧光显微镜原位检测HaCaT细胞染色体上的5-甲基胞嘧啶,美国Epigentek公司MethylflashTM甲基化DNA定量试剂盒检测HaCaT细胞基因组DNA甲基化水平。结果显示,丹参酮ⅡA预处理可以降低UVB照射诱导的HaCaT细胞Gadd45α表达,抑制UVB照射诱导的HaCaT细胞基因组DNA甲基化水平降低。结论UVB照射可以诱导HaCaT细胞内活性氧族产生,导致线粒体水肿、细胞质膜破坏,损伤严重的细胞发生凋亡,为了修复UVB照射损伤,Gadd45a的表达上调,细胞基因组DNA甲基化水平降低。具有抗氧化能力的丹参酮ⅡA对于HaCaT细胞各种UVB照射引起的细胞生物学改变均有一定的抑制作用。
【作者】吴侃；
【导师】孙建方；
【作者基本信息】北京协和医学院，皮肤病与性病学，2014，博士
【关键词】丹参酮ⅡA；光毒性反应；活性氧族；Gadd45α；基因组DNA甲基化水平降低；

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