家蚕Hippo信号通路主要基因的研究

【摘要】Hippo信号通路是一条细胞抑制生长性信号通路,在生物进化的过程中十分保守。在果蝇中,Hippo信号通路的上游膜蛋白受体感受到细胞外的生长抑制信号后,经过一系列激酶复合物的磷酸化级联反应,最终将磷酸化下游的效应因子YKI。磷酸化的YKI与细胞骨架蛋白相互作用,使其被滞留在细胞质内,不能进入细胞核行使其转录激活功能,从而实现对器官大小和体积的调控。鳞翅目昆虫家蚕是一种典型的模式经济昆虫,虽然在果蝇和哺乳动物中Hippo信号通路研究报道的比较多,但是在家蚕这一鳞翅目昆虫的模式种中还很少被研究和报道。本研究在成功克隆BmHpo、BmSav、BmWts、BmMats、BmYki基因的基础上,检测了这些基因在家蚕不同组织、不同龄期的表达水平,探讨了过表达BmYki1及其突变体对培养细胞大小、周期的影响,研究了BmYki1基因表达对家蚕Hippo信号通路上下游基因的调节作用,并探究了抑制BmYki1的表达对翅原基发育的影响,期望通过探讨家蚕Hippo信号通路明确BmYki基因的功能,为家蚕丝腺、生殖腺和翅原基的人为发育调节提供新的思路。本研究取得的主要结果如下：1.家蚕Hippo通路主要基因的克隆及序列分析为了研究家蚕Hippo信号通路主要基因的功能,通过电子克隆获得了家蚕Hpo、Sav、Wts、Mats和Yki基因序列。根据电子克隆的序列设计引物进行RT-PCR,克隆测序结果显示,BmHpo的ORF为1479,编码492aa,GenBank登录号为KF904333。BmSav的ORF为1209,编码402aa,GenBank登录号为KF904337。BmWts的ORF为1535,编码510aa,GenBank登录号为KF904338。BmMats共有三种不同的剪接体,分别命名为BmMatsl、BmMats2和BmMats3,ORF大小分别为570、564和570,分别编码189,187和189aa,GenBank登录号为KF904334、KF904335和KF904336。与BmMatsl相比,BmMats2第4外显子缺少6个碱基,BmMats3在第245nt为T,第513nt为G。BmYki基因共有三种可变剪接亚型,分别命名为BmYkil、BmYki2和BmYki3,ORF大小分别为1314、1173和1335,分别编码437,390和444aa,GenBank登录号为KF904339、KF904310和KF904311。与BmYki1相比,BmYM2缺少第3外显子,BmYki3第5外显子3’端和第6外显子5’端分别增加了15和6个碱基。结构分析显示,BmHPO、BmWTS和BmMATS1蛋白的二级结构主要为无规卷曲和α螺旋,BmSAV和BmYKI1蛋白的二级结构主要为无规卷曲。BmHPO和BmWTS含有激酶结构域,推测其具有激酶活性；BmSAV和BmYKI1含有WW结构域,能广泛参与细胞内多种生化过程和信号通路。WTS和MATS1在家蚕和果蝇中同源性较高,表明WTS和MATS1蛋白在这两种昆虫中非常保守,可能发挥着相似的作用。基于YKI氨基酸序列的分子进化分析表明,脊椎动物的YKI聚为一类,无脊椎动物聚为另一类。YKI蛋白在不同物种中具有一定的同源性。2.家蚕Hippo通路主要基因表达谱分析为了探讨家蚕Hippo信号通路主要基因的表达规律,通过实时定量PCR(Real-TimePCR)分析了BmHpo、BmSav、BmWts、BmMats和BmYki基因在家蚕五龄第3天不同组织和性腺不同发育时期的表达水平。在五龄第3天不同组织中,BmHpo、BmSav和BmYki2基因在各组织中表达量均较低,BmWts和BmMats基因在头部和气管丛的表达量较高,BmYkil/3基因在中肠中表达量最高,在血细胞中表达量最低。在所检测的发育时期中,各基因五龄第7天和蛹期第2天卵巢的表达水平最高,BmYkil/3基因较其他几个基因相比表达量较高。BmYkil/3基因在五龄第7天卵巢的表达量最高,BmYki2基因在化蛹第2天卵巢较其他发育阶段表达量较高,暗示各基因的表达水平与所在组织／细胞的发育分化程度相关。3.BmYKI1及BmYKI1S97A的亚细胞定位及蛋白水平检测辅助转录因子YKI是Hippo信号通路中最重要的组分,为了探讨BmYKI的表达规律以及细胞定位特征,将BmYki1基因克隆进原核表达载体pET-28a(+),在E.coli中成功表达了重组BmYKI1,并利用重组蛋白免疫小鼠,制备了抗BmYKIl多抗。五龄第3天家蚕主要组织的Westernblotting检测结果显示,在精巢、卵巢、中肠、丝腺、脂肪体、气管丛中可检测到BmYKI蛋白,但在头部和马氏管中没有观察到明显的信号条带。细胞定位结果显示,BmYKI1主要定位在BmN细胞的细胞质中。将BmYKI1重要磷酸化位点S97突变成A(BmYKI1S97A),发现BmYKI1S97A转移至细胞核,表明BmYKI1的磷酸化对于该蛋白的细胞定位起着重要作用。4.调节家蚕Yki基因表达对家蚕翅原基及家蚕培养细胞的影响为了探讨BmYki1基因的功能,本研究通过过表达和RNAi的方法调查了上调BmYki1和BmYkilS97A基因,下调BmYki1基因对家蚕培养细胞和翅原基发育以及Hippo信号通路上下游基因表达水平的影响。结果显示,过表达BmYki1和BmYki1S97A基因后BmN培养细胞的体积增大了23%和27%,处于分裂期细胞较对照BmN细胞分别提高了14.7%和10%。过表达BmYkil基因后,fj、crb、serr、wntcat、bmpr和dpp基因的表达水平较对照BmN细胞有明显增加；过表达BmYkilS97A基因后,ex、kibra和fj基因的表达水平较对照BmN细胞有所提高。表明调节家蚕BmYki1和BmYki1S97A基因的表达可调节细胞的分裂周期和细胞体积。RNAi干扰Yki基因表达后,家蚕细胞中的ex基因表达水平下降了2.25倍,kibra基因表达水平下降了1.67倍。对蚕蛹右侧翅原基注射yki-siRNA-298后,蚕蛾右侧翅发生萎缩的比例达到35%,后翅萎缩的比例大于前翅,最严重的后翅萎缩可达到58.3%。同时ex基因表达水平降低了1.95倍,crb基因表达水平降低了8.20倍。Hippo信号通路上游基因wts、fj和serr的表达水平均有显著上调。表明调节家蚕Yki基因表达可影响Hippo信号通路上、下游基因的表达和翅原基的发育。综上,本研究克隆了家蚕Hippo信号通路主要基因,明确了各基因的主要序列特征和表达模式,发现BmYki1基因对Hippo信号通路上下游基因的表达有调控作用,调节BmYkil基因的表达水平可影响培养细胞的体积、细胞周期和翅原基的发育。研究结果不仅加深了对家蚕Hippo信号通路作用机制的理解,而且为家蚕卵巢、丝腺、翅等器官大小的调控提供新的思路。
【作者】钱莹；
【导师】贡成良；
【作者基本信息】苏州大学，生物化学与分子生物学，2014，硕士
【关键词】家蚕；Hippo信号通路；表达模式；BmYki基因；RNAi；培养细胞；翅原基；

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