高血压表观遗传学调控机制研究及高血压并发症—脑卒中的遗传危险因素研究

【摘要】目的：心脑血管病是人类健康的最主要威胁之一,高血压是心脑血管病的最大危险因素,并已成为我国沉重社会负担。因此阐明高血压的发生、发展和转归规律仍是高血压防治的关键。研究表明,高血压是一种遗传和环境因素相互作用的复杂疾病。候选基因策略和全基因组关联研究获得的所有易感位点均未显示出与高血压的较强关联性,高血压的病因问题仍然没有确定解释。近年来,高血压表观遗传学研究已经找到一些线索,可能在环境因素与核基因组间起到沟通桥梁作用,在没有发生基因组变异的情况下影响基因表达水平,从而影响疾病的易感性。DNA甲基化是4个表观遗传调控的重要方式之一。但是在高血压领域,DNA甲基化的研究还有很多问题亟待解答,关于人类高血压全基因组的甲基化研究还鲜有报道。本论文的第一分题从全基因组水平在极端高血压和完美对照组之间,高血压前期未转化和转化组之间比较了外周血DNA甲基化谱的差异,并从两者的交集中找到了两个可能与高血压发病机制相关的DNA甲基化差异位点,并做了初步功能研究。同时,选取与中国人群高血压相关的GWAS阳性位点,初步探索了DNA甲基化修饰作用对表型的影响。方法：选取来自于山东省日照社区的44例完美对照,44例极端高血压患者,44例前期高血压样本,采用Illumina450KBeadChip甲基化芯片检测所有个体的外周血DNA甲基化状态。采用焦磷酸测序技术重复第一人群芯片结果,随后在扩大的70例完美对照和133例高血压病例中验证阳性的CpG甲基化位点。经两阶段的筛选找出与高血压相关的OVGP1基因。ELISA检测高血压与对照组间的血浆OVGP1蛋白水平。实时荧光定量PCR、Western-blot和免疫荧光实验用于检测OVGP1在内皮细胞的表达。进一步用pull-down实验捕获与OVGP1相互作用的蛋白,并用慢病毒转染HUVEC和THP1细胞,高表达OVGP1,检测高血压相关分子的mRNA水平变化。另一方面,用SNPshot法对第一阶段的高血压和对照人群分析rs1842896和rs7136259两个位点的基因型,结合DNA甲基化数据,分析表观遗传、遗传变异和表型的关系。结果：在全基因组DNA甲基化筛选阶段共有14个甲基化差异位点在完美对照和极端高血压、高血压前期未转化和转化两个病例对照中均有显著差异,并且甲基化升高或降低的趋势相同。在焦磷酸测序验证后,分别位于OVGP1和CPO基因启动子区的cg20823859和cg17600943位点的甲基化水平在高血压病例中均显著降低,平均甲基化差异分别为-0.11和-0.10,校正年龄、性别和BMI后仍具有显著性(P=0.02和P=0.001)。血浆中OVGP1蛋白水平在高血压人群中也显著高于对照组。OVGP1基因的功能初探结果显示,OVGP1在HUVEC胞浆中表达,通过pull-down捕获到25个可能与OVGP1相互作用的蛋白,其中4个蛋白与高血压的病理过程显著相关。进一步研究发现OVGP1表达升高可使HUVEC和THP1中TGF-β1和GF-β2的mRNA水平分别升高。基因分型结果显示,已知的中国高血压人群易感位点rs1842896在88例高血压病人和对照中的分布频率具有显著性差异(P<0.05)。携带有TT基因型的个体中,极端高血压患者在cg21176026位点的甲基化程度也显著低于完美对照(P<0.05),而TG+GG基因型的个体中两组无差异(P=0.39)。进一步我们发现,以DNA甲基化程度β=0.75为临界点,TT基因型携带者并伴随低甲基化状态发生高血压的几率增高,提示cg21176026位点的甲基化修饰可影响高血压危险等位基因rs1842896-T的作用。结论：本研究采用全基因组甲基化研究策略,初步证明表观遗传调控可能参与高血压的发生发展,并找到两个与高血压发病相关的新靶基因OVGP1和CPO。本研究也探索了遗传变异、表观遗传修饰和高血压的关系,并推断了可能的相互作用模型。但是深入的分子机制仍需进一步研究。目的：尿酸是嘌呤的代谢终产物。过多的摄取富含嘌呤和果糖的食物已成为目前尿酸水平升高,继而出现高尿酸血症的重要原因。高尿酸血症除了引起痛风,还被认为是高血压、心脏病、肾病和脑卒中的重要危险因素之一。尿酸水平的升高常常先于高血压出现,提示尿酸作为独立的内源性环境因素,直接参与了导致高血压的病理生理过程。本研究采用全基因组DNA甲基化差异筛选策略,研究高尿酸导致高血压的表观遗传机制。方法：选取来自于山东省日照社区的12例高尿酸血症患者,44例完美对照,44例极端高血压患者,采用Illumina450KBeadChip甲基化芯片检测所有外周血DNA甲基化状态。首先从高尿酸血症患者和完美对照外周血DNA中寻找与高尿酸血症相关的DNA甲基化差异位点,进一步与极端高血压和完美对照间的DNA甲基化差异位点取交集,获得7个在两组比较中DNA甲基化变化一致的位点。随后,在体外用尿酸刺激细胞,检测与差异甲基化位点临近基因的mRNA表达水平的改变。结果：获得7个可能参与高尿酸导致高血压发病机制相关的DNA甲基化差异位点。其中cg15711973、cg23812489、cg02157463和cg23947654位点在高尿酸血症和极端高血压患者中甲基化程度均降低,eg12252547、cg06827234和cg16051083也在两个病例组中均升高。体外实验显示,尿酸的刺激可以使THP1和Jurkat两种免疫细胞内FLG2的mRNA表达水平显著升高。这与甲基化芯片中,位于FLG2上游TSS1500区CpG位点cg23812489的甲基化水平降低的结果是相符的。位于MAL2启动子区的cg12252547位点在芯片结果中病例组的甲基化水平高于对照组,在体外尿酸刺激下,能使THP1细胞中MAL2的mRNA水平降低,但Jurkat细胞中MAL2的表达水平没有显著改变。cg02157463位点处于JPH3基因的基因体区,在病人体内甲基化程度升高,相对应地,当尿酸刺激THP1和Jurkat细胞时,JPH3的mRNA水平显著降低。但是,我们并没有检测到其它的候选基因(TANC1,PCDHA,ZDHHC14)mRNA表达水平的改变。结论：本研究采用全基因组DNA甲基化差异位点筛选研究策略,获得了6个可能与高尿酸导致高血压发病相关联的候选基因。这些基因多与钙离子相关通路和神经信号传递有关,提示尿酸升高有可能通过改变基因组中这些基因的DNA甲基化程度,调节基因表达水平,继而参与高尿酸导致高血压的致病过程。本论文的第一部分研究了高血压发生发展过程中表观遗传学调控机制,在本部分将探讨高血压引起的最为主要的并发症之一——脑卒中的遗传危险因素。由于高血压可直接引起颅内动脉瘤或血管畸形的破裂而发生出血性脑卒,且颅内动脉瘤的病因中遗传因素占据了更主导的地位,因此本部分将以颅内动脉瘤为模型,研究高血压并发症的遗传危险因素。颅内动脉瘤的破裂能够导致严重的致死性后果。多项全基因组关联研究(genome-wideassociationstudies,GWAS)已经在欧洲人群完成,但是迄今还没有在中国汉族人群开展颅内动脉瘤GWAS研究的报道。为验证欧洲颅内动脉瘤GWAS关联研究发现的新易感位点,本研究在大样本的中国汉人群中调查了10个单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)位点与颅内动脉瘤的关联性。选取649例中国汉族散发颅内动脉瘤患者和1682名正常人,对GWAS研究中已报道的10个候选易感位点采用时间飞行质谱生物芯片系统(SequenomMassArray)进行基因分型。采用X2检验、logistic回归分析对SNP位点的基因型、等位基因进行相关性分析。结果显示,携带rs12413409-G和rs1980781-C等位基因的个体在病例和对照组中的频率具有显著差异(均为P=0.002),并使患颅内动脉瘤的风险分别增加1.27和1.26倍,并达到Bonferroni校正的检验水准。在加性遗传模式下,rs12413409和rs1980781也与颅内动脉瘤显著相关(分别为OR=1.27,95%CI1.09-1.48,P=0.002和OR=1.26,95%CI1.09-1.45,P=0.002)。进一步按照年龄、破裂与未破裂、动脉瘤的数量分层后发现,在小于60岁的个体中上述两个易感位点与颅内动脉瘤的关联性增强。在等位基因和加性遗传模型的关联分析中,rs12413409和rs1980781可使颅内动脉瘤的破裂风险分别增加1.25倍和1.24倍(P<0.005)。携带rs12413409-G和rs1980781-C的个体也更倾向于罹患单发的颅内动脉瘤。而之前GWAS研究报道的其它8个易感基因在本研究中并未显示与中国汉人群颅内动脉瘤具有关联性。本研究验证了欧洲人群GWAS研究获得的rs12413409和rs1980781两个易感位点,提示它们可能是中国汉人群颅内动脉瘤的遗传风险因素之一。
【作者】蔺亚晖；
【导师】惠汝太；
【作者基本信息】北京协和医学院，生物化学与分子生物学，2014，博士
【关键词】高血压；DNA甲基化；全基因组；表观遗传修饰；尿酸；表观遗传学；颅内动脉瘤；遗传变异；易感基因；中国汉族；

【参考文献】
[1]张利剑.专科院校后勤人员的职业素质现状及提升对策[D].河北大学,工商管理（专业学位）,2014,硕士.
[2]刘永才.基于OMAP3530的羊绒羊毛图像识别系统的研究[D].北京服装学院,机械电子工程,2012,硕士.
[3]王树祥,张明玉,王杰群.生产要素的知识属性与知识价值链研究[J].中国软科学,2014,04:160-168.
[4]詹婧.论美国媒体诽谤诉讼举证责任分配制度的历史变迁[D].中国政法大学,新闻学,2014,硕士.
[5]袁海钧.论经济性裁员的法律规制[D].西南政法大学,经济法学（专业学位）,2012,硕士.
[6]徐鸣雷,栾庆伟.基于3C的市场定位决策模型及其应用[J].控制与决策,2005,05:592-594.
[7]李天文.高中信息技术自主学习模式的应用研究[D].山东师范大学,教育（专业学位）,2013,硕士.
[8]罗希权,张晓冬.21世纪洗涤剂原料的发展趋势[J].精细与专用化学品.1999(14)
[9]刘艳红.员工忠诚度的影响因素研究[D].河北经贸大学,企业管理,2012,硕士.
[10]张少中.基于贝叶斯网络的知识发现与决策应用研究[D].大连理工大学,2003.
[11]严梅.基于Web服务的开放式数据挖掘引擎在电子商务中的应用[D].东华大学,2005.
[12]何典,宋中山.基于Web挖掘的个性化网络教育研究[J].计算机与现代化,2005,05:100-102.
[13]徐芙蓉.基于超微弱发光检测辐照含糖食品的研究[D].浙江大学,作物学（专业学位）,2012,硕士.
[14]李兵.不同光照和水流条件下底泥释放氮磷规律的研究[D].成都理工大学,环境工程,2013,硕士.
[15]郭啊敏.青少年英语夏令营教学活动设计研究[D].上海外国语大学,教育技术学,2012,硕士.
[16]莫祖英,马费成.数据库信息资源内容质量用户满意度模型及实证研究[J].中国图书馆学报,2013,02:85-97.
[17]许静.我国社区社会组织培育与发展的研究[D].宁波大学,公共管理（专业学位）,2013,硕士.
[18]万道静.南海海表盐度的分布特征[D].中国海洋大学,地图学与地理信息系统,2014,硕士.
[19]孙道.中国自动化学会召开新春座谈会[J].自动化学报,1983,02:156.
[20]朱倩.『阿Q正伝』におけゐ“文化负载词”の日本語訳につぃて[D].首都师范大学,日语语言文学,2013,硕士.
[21]王志定.谈谈建筑节能的几项技术措施[J].宁波节能.2007(02)
[22]余志文.周界围栏探测系统的研究与设计[D].东北大学,检测技术与自动化装置,2011,硕士.
[23]孟菲菲.信息网络传播侵权行为认定及责任承担[D].辽宁大学,法律,2012,硕士.
[24]徐晓岚.非政府组织跨文化管理研究[D].云南大学,工商管理,2012,硕士.
[25]张爽爽.六味地黄汤对5/6肾切除大鼠肾脏WT1及PAX2表达的影响[D].湖南中医药大学,中医内科学,2013,硕士.
[26]周季夫.基于快速氧化实验的巷道周边煤体自燃数值模拟研究[D].大连理工大学,供热、供燃气、通风与空调工程,2013,硕士.
[27]王楚.模块化多电平变流器相间环流抑制的研究[D].华东交通大学,电力电子与电力传动,2013,硕士.
[28]段若玲.我国金枪鱼渔业发展现状及其开发前景[J].现代渔业信息.1989(Z1)
[29]卢玉婷.基于SVM的闸机目标识别方法的研究[D].南京理工大学,概率论与数理统计,2013,硕士.
[30]李桃君.预制预应力双T板的程序设计以及有限元分析[D].北京建筑大学,结构工程,2013,硕士.
[31]张文正.中国金融条件指数的构建及其应用研究[D].南京师范大学,金融学,2012,硕士.
[32]崔国栋.无线传感器网络节点定位与路由协议研究[D].南京邮电大学,计算机应用技术,2013,硕士.
[33]郑建国.基于UML的贵州公路集团账务处理系统的分析与设计[D].云南大学,软件工程,2012,硕士.
[34]孙晴.氢酶碳纳米管分子聚集体材料的制备及其性能表征[D].复旦大学,2011.
[35]袁淑华.基于移动互联网的营销传播策略研究[D].大连海事大学,工商管理,2014,硕士.
[36]胡海立.我国赃物善意取得制度研究[D].华中科技大学,法律,2013,硕士.
[37]王扶林.我院第四届科研成果、优秀著作、优秀论文评审工作结束[J].石油管理干部学院学报.1999(01)
[38]刘春芳,肖坤叶,徐虹,史彩娟.海外低勘探程度地区勘探技术与应用[J].石油地球物理勘探,2006,S1:62-65+142+146.
[39]苏云利,刘俊宽,殷志勇.唐钢FTSR薄板坯连铸连轧生产线简介[J].钢铁研究.2003(02)
[40]巴尔登.试探《贡唐教诲》的教育思想及其艺术特点[D].西北民族大学,中国少数民族语言文学,2012,硕士.
[41]范正赟,张卫东,沈海波,张建良,国宏伟.大型高炉炉型管理综合模型的开发研究[J].冶金自动化,2015,02:47-51+57.
[42]吴建芳.客运营销分析与辅助决策系统的设计与研究[J].中国铁路.2006(03)
[43]耿晓辉.俄语言语文明的变迁[D].黑龙江大学,俄语语言文学,2013,硕士.
[44]王海波.基于数据挖掘的客户关系管理研究[D].大连理工大学,管理科学与工程,2004,硕士.
[45]丁和才.企业社会资本与战略选择的匹配对企业绩效的影响研究[D].浙江工业大学,2008.
[46]周洁雯.小儿咳喘宁口服液治疗RSV感染毛细支气管炎的临床研究[D].广州中医药大学,中医儿科学（专业学位）,2013,硕士.
[47]胡俊.基于关联领域的文献趋势分析系统的设计与实现[D].华中科技大学,软件工程,2013,硕士.
[48]张萍.～（131）I-GMCSF诱导HL60/ADM细胞凋亡的研究[D].重庆医科大学,内科学,2004,硕士.
[49]陈超.不同中医体质代谢综合征人群的人体成分特征研究[D].广州中医药大学,中医学（专业学位）,2013,硕士.
[50]张磊.基于微平面电机的姿控飞轮系统设计[D].中国科学院研究生院（长春光学精密机械与物理研究所）,机械制造及其自动化,2012,硕士.