家蚕杆状病毒表面展示SARS-CoV N、RBD蛋白及其免疫原性研究

【摘要】严重急性呼吸综合征（SevereAcuteRespiratorySyndromes），又称传染性非典型肺炎，简称SARS，是一种因感染SARS-CoV引起的新呼吸系统传染性疾病。本实验尝试利用家蚕杆状病毒表面展示技术将SARS-CoV主要结构蛋白N蛋白（Nucleocapsidprotein）及S蛋白（Spikeprotein）的受体结合区域（ReceptorBindingdomain即RBD）共展示在杆状病毒囊膜表面，通过低离、高离、超离等步骤纯化，得到纯重组杆状病毒vBmgp64-N-RBD，灭活后免疫BALB/c小鼠获得抗血清，并对其免疫原性进行初步研究，为SARS双价基因工程亚单位疫苗奠定一定的基础。同时构建重组杆状病毒vBmgp64-N、vBmgp64-RBD，后续工作同vBmgp64-N-RBD，通过比较三种免疫抗血清，研究三种重组杆状病毒的免疫原性。首先运用E.coLiBL21表达系统，分别表达SARS-CoVN蛋白和RBD蛋白，镍柱亲和层析法纯化目的蛋白，得到高纯度N蛋白和RBD蛋白，分别免疫新西兰雄兔制备多克隆抗体，抗体经纯化后间接ELISA法测定其效价，N蛋白免疫获得的抗血清达1∶25600，RBD蛋白免疫获得的抗血清达1∶12800；然后利用Bac-to-Bac系统获取重组杆状病毒vBmgp64-N、vBmgp64-RBD、vBmgp64-N-RBD，经SDS-PAGE、WesternBlotting鉴定及激光共聚焦显微镜分析，结果表明三种重组杆状病毒相应的目的蛋白均成功表达展示于BmN细胞质膜上，三种灭活的纯重组杆状病毒粒子免疫BALB/c小鼠，初步研究目的蛋白的免疫原性，三种重组杆状病毒免疫小鼠获得的相应多抗效价均可达1∶6400，中和实验结果显示vBmgp64-N、vBmgp64-RBD、vBmgp64-N-RBD免疫小鼠获得的抗体中和效价分别为1∶16、1∶48、1∶50，说明N、RBD蛋白具有较好的抗原性且获得的抗体效价较高。本实验首次用表面展示技术在BmN细胞中开发新疫苗，进行了SARS疫苗研制新途径的尝试并取得了较好的初步结果，为后续疫苗的研究开发奠定了基础，且具有SARS疫苗方法学上的创新性。
【作者】闫晶晶；
【导师】张耀洲；
【作者基本信息】浙江理工大学，生物化学与分子生物学，2014，硕士
【关键词】SARS-CoV；多克隆抗体；杆状病毒表面展示技术；免疫原性；

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