USP19在DNA双链损伤应答中的功能及机制研究

【摘要】细胞周期的正常运行，尤其是有丝分裂期的一系列复杂而精细事件的调控，是保证基因组稳定性的关键[1]。遗传物质在复制后，经过有丝分裂期的染色体的正确分离，平均地分给子代细胞。DNA损伤普遍存在于整个细胞周期，当DNA发生损伤时，正常细胞可以激活相应的周期检查点，延缓或阻滞有丝分裂进程并启动修复，待有效地完成修复后才继续分裂[2,3]；如果检查点失去正常功能或修复机制缺陷，受损的DNA带着错误进入有丝分裂，传到子代细胞，就引入了突变，突变随着有丝分裂而累积，从而引起基因组不稳定，最终导致肿瘤的发生[4-7]。DNA双链断裂是最严重的一种DNA损伤，相比其他DNA损伤后果更严重，如果不得到修复，细胞将面临染色体断裂和死亡，不正确的修复又可能导致肿瘤的发生[8]。细胞为了应对双链断裂，有两条修复途径：同源重组和非同源末端连接，两条途径共同维持细胞的基因组稳定[1,9-12]。DNA损伤是肿瘤治疗的常用手段，因此，DNA修复在肿瘤治疗中至关重要。DNA修复缺陷会导致细胞对DNA损伤高度敏感[13]，但当DNA修复能力异常增强，则导致肿瘤耐受DNA损伤刺激，即产生耐药[14,15]。同时，DNA修复缺陷的生物个体经常有各种遗传病症，通常随着年龄的增长有极高的罹患癌症的几率。因此，以DNA修复作为靶点，是肿瘤临床辅助治疗的重要思路[16]。本项工作利用siRNA基因沉默高通量筛选平台，结合Time-lapse活细胞实时成像技术，筛选调控有丝分裂的新功能蛋白。筛选结果发现USP19参与调控细胞有丝分裂，敲低USP19表达导致肿瘤细胞在有丝分裂后期出现染色体错误分离（chromosomemis-segregation）的比率升高，形成“染色体桥”和“微核”，提示细胞的DNA损伤应答及修复机制失常。同时，持续增加的染色体错误分离比率是导致染色体不稳定性和肿瘤发生的重要因素之一[17,18]。USP19是泛素特异性加工酶（ubiquitin-specificprocessingenzymes,UBPs或USPs），属于去泛素化酶的一员，在组织中广泛表达。USP19能水解底物蛋白上的泛素链的链接，起到去泛素化的作用。USP19在缺氧、内质网应激、肌肉萎缩、细胞增殖中发挥一定作用[19-21]，目前对USP19的功能研究比较少，且没有关于DNA损伤及修复方面的任何报道，但是磷酸化蛋白质组的大规模筛选鉴定到USP19有DNA损伤相关的磷酸化位点，因此，深入研究USP19参与DNA损伤应答及修复的功能及分子机制有其重要意义。在此基础上，为了确证USP19蛋白质在维持染色体稳定性中的作用，展开了初步探索，研究进展如下：⑴首先在蛋白水平检测了IR导致DNA双链断裂的情况下USP19的蛋白量，发现USP19受IR诱导表达上调，表明USP19可能在DNA损伤反应中发挥一定的功能。⑵根据调研，USP19含有SQ磷酸化位点，该位点易被ATM/ATR激酶识别[22]。为了验证USP19是否能被ATM/ATR磷酸化[22]，外源转染Flag-USP19后，用Flagbeads富集UV或IR处理前后的Flag-USP19，以特异性识别phospho-SQ/TQ的抗体孵育，发现在UV或IR处理后USP19确实被磷酸化，而且它的磷酸化会被PIKK抑制剂wortmannin抑制，说明USP19的激酶确实属于PIKK激酶。⑶敲低USP19的蛋白表达，检测IR辐射后DNA损伤应答相关蛋白的水平，发现多个损伤反应蛋白的磷酸化水平降低，包括p-Chk1(Ser317),p-Chk2(Thr68),p-KAP1(Ser824)及γ-H2AX，辐射后检查点导致的G2/M阻滞也有延后，这些结果表明USP19对DNA损伤应答具有重要作用；⑷利用HR和NHEJ修复报告系统，直接检测了敲低USP19对双链断裂修复能力的影响，发现敲低USP19表达后HR和NHEJ都有上调，尤其是NHEJ修复途径，提示USP19参与调控双链断裂的修复。“染色体桥”的成因就是染色体末端通过NHEJ途径融合，敲低的USP19“染色体桥”增多，和敲低后NHEJ途径增强，是具有一致性的。同时，敲低USP19后细胞DNA修复能力变强可能与肿瘤细胞耐药的机制有关；⑸细胞内源相互作用数据库提示USP19与HDAC1和HDAC2可能存在于一个功能复合体内[23]，通过co-IP，我们验证了USP19与HDAC1和HDAC2确实存在相互作用。已有多篇文献报道HDAC1和HDAC2能促进DNA双链断裂修复，尤其是非同源末端连接，这提示USP19可能部分通过HDAC1和HDAC2发挥其在DNA修复方面的功能；⑹生物信息学分析发现USP19在卵巢癌和头颈癌中存在缺失，提示USP19对肿瘤发生发展的作用。综上所述，我们对USP19参与调节DNA损伤及修复的机制进行了推想，一方面USP19可能通过调控DDR相关蛋白的修饰而影响DNA损伤应答，另一方面可能通过调控HDAC1和HDAC2的活性从而影响DNA修复。USP19是一个功能尚待更多探索的蛋白质，本项工作新发现了其参与调控DNA双链损伤应答及修复方面，为进一步明确USP19的功能及分子机制，揭示USP19在肿瘤发生发展及耐药中的角色提供了新的线索。
【作者】杨扬；
【导师】张学敏；
【作者基本信息】中国人民解放军军事医学科学院，细胞生物学，2014，博士
【关键词】USP19；DNA损伤应答；DNA修复；染色体不稳定性；

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