致倦库蚊和骚扰库蚊差异表达的气味受体（OR）基因的功能研究

【摘要】致倦库蚊（Culexpipiensquinquefasciatus）广泛分布于全球热带及亚热带地区，也是我国南方地区最常见的蚊种之一，它不仅是我国淋巴丝虫病和流行性乙型脑炎的重要传播媒介，也是西尼罗热、西方马脑炎等烈性虫媒传染病在我国的潜在传播媒介。致倦库蚊兼吸人、哺乳动物、鸟等多种宿主的血液，可使原本储存于动物宿主中的病原体传播至人群，所以，一直以来致倦库蚊都被列为重点防治对象。化学防治是目前致倦库蚊最主要的防治方法，但蚊虫抗药性的出现及抗药性水平的不断提高，导致防治效果越来越差，同时还对环境造成污染。因此，寻找一种对环境友好且安全有效的新型防治方法已迫在眉睫。以往的研究发现，蚊虫很多重要的行为都是依赖嗅觉系统完成的，并由遗传基因所决定。蚊虫的嗅觉系统包含多种嗅觉蛋白，气味受体是其中比较重要的一种嗅觉蛋白，气味受体识别气味结合蛋白（OBPs）携带的气味分子并激活嗅觉神经元是嗅觉信号传导过程中的关键步骤，也是蚊虫完成搜寻定位宿主、吸血产卵等行为的分子基础。如果能够明确气味受体的功能，不仅对于阐明蚊虫的嗅觉机理十分重要；同时，对于寻找防治蚊虫的新靶标，发展新的方法来干扰或阻断蚊虫寻找宿主吸血的过程，开辟新的蚊虫治理途径也具有重要的理论意义与应用价值。蚊虫在长期进化过程中，遵循“适者生存”的原则，为了满足自身生理行为的需求，已形成各具特色的气味受体蛋白家族，对气味物质表现出不同的灵敏度和辨识度，同时，蚊虫在不同生长阶段，可调控ORs基因表达与否及表达量的高低，表现出对气味物质不同的行为反应。在基因组工程完成的基础上，致倦库蚊大量的ORs基因被分离识别，绝大部分ORs基因的功能还处于未知状态，短时间内不可能逐一进行研究，只能通过筛选缩小范围，深入研究可能在致倦库蚊雌蚊搜寻宿主完成吸血行为中起关键作用的ORs基因，为开发新型蚊虫防治方法提供理论依据。骚扰库蚊(Culexpipiensmolestus)与致倦库蚊同属尖音库蚊复合组（CulexpipiensComplex），拥有相似的基因组，形态特征不容易区分，但生理行为方面存在明显的差异，其中最为典型的是骚扰库蚊属自育性蚊虫，雌蚊第一次产卵不需要吸血也可完成。实验室株骚扰库蚊即使第二个生殖周环也不吸血或很少吸血，与致倦库蚊相比，ORs基因表达量一定存在差异。如果ORs基因在致倦库蚊头部高表达，而在骚扰库蚊头部低表达或不表达，那么这些ORs基因很可能参与完成致倦库蚊雌蚊搜寻宿主、吸血等行为。本研究希望从致倦库蚊和骚扰库蚊的吸血习性差异入手，从致倦库蚊较多的气味受体ORs中筛选出与雌蚊吸血行为相关的ORs基因。首先通过高通量测序和RT-PCR方法筛选两亚种之间差异分布的ORs基因，并运用荧光定量PCR方法进一步比较差异分布的ORs基因在致倦库蚊和骚扰库蚊雌蚊头部的起始表达量，借助RNA干扰技术验证起始表达量差异较大ORs基因是否在致倦库蚊雌蚊吸血行为中起关键作用。结果如下：（1）根据致倦库蚊132个ORs基因序列，设计192对引物，利用RT-PCR方法扩增ORs基因，经测序比对发现成功扩增125个ORs基因，占总数的95%，未扩增ORs基因数7个。（2）比较成功扩增的125个ORs基因在致倦库蚊和骚扰库蚊雌蚊不同组织部位及雄蚊中的分布，结果显示101个ORs基因在致倦库蚊和骚扰库蚊雌蚊头、胸、腹、足和雄蚊中均有分布，24个ORs基因在致倦库蚊和骚扰库蚊雌蚊头、胸、腹、足和雄蚊中存在差异分布，其中13个ORs基因在致倦库蚊和骚扰库蚊雌蚊头部差异分布。（3）参考高通量测序结果，在致倦库蚊和骚扰库蚊雌蚊中表达量差异较大的33个ORs基因。（4）荧光定量PCR技术分析比较43个ORs基因（13个在致倦库蚊和骚扰库蚊雌蚊头部差异分布的ORs基因和33个高通量测序筛选出的ORs基因，3个ORs基因重复）在致倦库蚊和骚扰库蚊雌蚊头部的起始表达量，其中4个ORs基因（CquiOR25，CquiOR38，CquiOR41和CquiOR68）在致倦库蚊和骚扰库蚊雌蚊头部表达量无显著差异；39个在致倦库蚊和骚扰库蚊雌蚊头部表达量具有显著差异的ORs基因中，26个ORs基因在致倦库蚊雌蚊头部的表达量显著高于骚扰库蚊，其中CquiOR5，CquiOR104，CquiOR117表达量差异倍数都大于500倍。（5）通过RNA干扰技术，验证CquiOR5，CquiOR104和CquiOR117基因是否在致倦库蚊雌蚊完成吸血行为中起关键作用，结果发现靶标基因CquiOR5被干扰后，雌蚊对宿主吸血反应时间延长，对雌蚊吸血行为有抑制作用；靶标基因CquiOR117被干扰后，不影响致倦库蚊雌蚊的吸血行为；CquiOR104未被成功干扰。
【作者】阎婷；
【导师】赵彤言；
【作者基本信息】中国人民解放军军事医学科学院，病原生物学，2014，博士
【关键词】致倦库蚊；骚扰库蚊；气味受体；基因差异表达；荧光定量PCR；RNA干扰；

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