miR-133b调控CTGF表达在结直肠癌上皮间质转化中的作用机制研究

【摘要】研究背景：结直肠癌是世界上高发的消化道恶性肿瘤之一,死亡率高。我国结直肠癌发病率逐年上升,严重影响生活质量,危害人们的生命健康。结直肠癌致病致死的主要原因是肿瘤的转移,而肿瘤细胞发生上皮间质转化(Epithelial-mesenchymaltransition,EMT)是肿瘤转移的关键所在。EMT是指具有上皮表型的细胞在多种生理或病理因素的刺激下,上皮结构消失,失去细胞极性和紧密连接,表现为细胞内骨架成分重排并获得移行能力等间质细胞的特性,转化为间质表型细胞的现象。研究发现,EMT现象在多种恶性肿瘤的侵袭和远处转移中存在,说明两者有着密切的联系。microRNA(miRNA)是一类内源性并且高度保守的非编码小分子RNA,大小约22个核苷酸左右,通过与靶基因mRNA3’-UTR的碱基互补配对后,抑制mRNA翻译过程或促进mRNA的降解,能抑制靶基因在转录后水平的表达,从而调控基因发挥生物功能。目前对miRNA的生物学功能众说纷纭,研究主要集中在miRNA调节生物体生长、发育、细胞分化、凋亡及肿瘤形成等众多方面,尤其在某些恶性肿瘤当中,miRNA可以调控不同的靶基因的特性,使得其能够来充当类似于原癌或抑癌基因的角色。最近的研究结果证实,miRNA-133b(miR-133b)的表达异常是肿瘤发生发展的重要环节,对肿瘤形成有促进作用,miR-133b在结肠癌中的差异表达已经被报道,但是其在结直肠癌中致癌、肿瘤转移机制及作用尚未完全明确。方法：本研究小组前期研究已经证实,miR-133b是一种新发现的在结直肠癌中具有抑瘤作用的miRNA,但仍有许多关键的问题没有得到解答,需进一步深入研究。本课题在前期工作的基础上,拟开展研究工作如下：1)通过靶点验证及细胞功能验证,对miR-133b在结直肠癌中的作用靶点进行系统分析和深入的研究,有望阐明miR-133b在结直肠癌中的作用机理；2)通过在结直肠癌标本中检测miR-133b及其靶基因的表达特征,分析miR-133b与结直肠癌各病理指标及临床指标之间的关系；3)通过结直肠癌EMT过程中的分子调控机制分析结直肠癌转移的可能原因。实验结果：1.miR-133b与CTGF在结直肠癌中的靶点验证生物信息学预测及基因芯片结果提示miR-133b的潜在靶基因参与TGF-β和Colorectalcancerpathway等通路。综合分析数据并进一步选择CTGF基因进行验证。实时荧光定量PCR(Real-timePCR)检测SW620、HT29细胞转染niR-133b过表达模拟物(mimics)和抑制表达载体(inhibitor)后靶基因的表达。结果初步提示miR-133b靶基因为CTGF。双荧光素酶实验：构建了含CTGF与miR-133b结合位点序列及其缺失突变型的pYr-Mir载体,运用双荧光素酶报告基因实验进行分析,结果提示：CTGF是miR-133b调控的靶基因。Western-blot证实转染miR-133b前后CTGF蛋白表达下调,表明：CTGF受miR-133b的转录后调控。2.miR-133b与CTGF在结直肠癌中的表达及临床病理特征相关性分析实时荧光定量PCR检测71对癌组织及癌旁组织样本中miR-133b的表达。结果显示：在66例癌组织样本中,miR-133b表达与配对癌旁组织相比明显下调,仅5例癌组织样本中miR-133b表达升高,存在显著性差异；CTGF在结直肠癌、癌旁组织中的免疫组化结果显示：结直肠癌组织中CTGF蛋白表达阳性率相比配对癌旁组织明显升高,存在显著性差异。Real-timePCR及免疫组化结果显示,miR-133b及CTGF的阳性表达与TNM分期以及有无淋巴结转移相关,与年龄、性别、分化程度、肿瘤大小和远处转移无关。3.miR-133b调控结直肠癌EMT过程的分子机制分析细胞转染miR-133b质粒后,细胞形态由纺锤形向类圆形改变,E-cadherin免疫荧光强度增强,vimentin免疫荧光强度减弱；RT-PCR和Westernblot证实代表上皮细胞表型的E-cadherin表达水平升高,代表间质细胞表型的vimentin表达水平下降；Transwell实验证实转染miR-133b质粒后CRC细胞的侵袭和迁移能力均下降。共转染miR-133b与CTGF过表达质粒后,E-cadherin免疫荧光强度减弱,vimentin免疫荧光强度增强；RT-PCR和Westernblot证实代表上皮细胞表型的E-cadherin表达水平下降,代表间质细胞表型的vimentin表达水平上升；Transwell实验证实共转染后CRC细胞的侵袭和迁移能力均上升。跟正常结直肠组织相比,结直肠癌组织中E-cadherin表达水平明显下降,CTGF及vimentin表达水平明显升高；组织中CTGF蛋白表达水平与E-cadherin呈负相关性,与vimentin呈正相关性；CTGF表达水平与患者淋巴结转移数目、临床进展等临床病理特征密切相关。结论：1.miR-133b在结直肠癌中是一种抑癌基因,可通过抑制靶基因CTGF达到抑制肿瘤侵袭及转移的效应。2.miR-133b参与调控结直肠癌EMT,CTGF是miR-133b调控结直肠癌EMT的关键调控环节。
【作者】郭一航；
【导师】李小荣；
【作者基本信息】中南大学，临床医学，2014，博士
【关键词】miR-133b；结直肠癌；结缔组织生长因子；上皮间质化；

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