黑龙江立克次体基因组与感染小鼠转录组研究

【摘要】黑龙江立克次体是我国学者首次分离的新立克次体病原体,属于立克次体属斑点热群立克次体,是远东斑点热的病原体。为了获得黑龙江立克次体全基因组序列,本研究进行了黑龙江立克次体的全基因组测序并进行了比较基因组和泛基因组研究。通过基因组分析发现,黑龙江立克次体基因组是一个全长1,278,471bp的环状基因组,没有质粒,基因组G+C含量为32.32%,有1,333个基因,其中编码蛋白质的基因1,297个,编码tRNA的基因有33个,编码rRNA的基因3个(5SrRNA、16SrRNA、23SrRNA各有1个)。进一步分析发现,黑龙江立克次体基因组有121个假基因和54个插入序列,还有39个串联重复序列和318个简单正向和反向重复序列。黑龙江立克次体基因组包含16个编码Ⅳ型分泌系统蛋白的基因。通过软件分析发现预测蛋白中有37个蛋白具有β-桶结构域,其中的8个已经被之前的实验证明是外膜蛋白。将预测蛋白与毒力因子数据库比对发现黑龙江立克次体有266个潜在的与毒力有关的蛋白。经耐药基因分析发现,黑龙江立克次体基因组中有7个序列与抗生素抗性基因有较高同源性。黑龙江立克次体基因组上有一个基因组岛,由7个ORF组成,其中两个是已知功能基因(一个是转座酶类似基因,另一个是virBl类似基因),另外5个是未知基因。通过比较基因组分析找到了黑龙江立克次体和日本立克次体共有的一段长度为4,500bp的区别于所有其他立克次体的序列,可用于黑龙江立克次体的鉴定与远东斑点热的诊断。通过黑龙江立克次体基因组与立氏立克次体SheilaSmith株、Iowa株的比较发现,黑龙江立克次体基因组有37个基因存在于SheilaSmith株基因组中却不存在于Iowa株基因组中,这些基因差异可能与黑龙江立克次体的致病性有关。泛基因组分析发现,包括黑龙江立克次体在内的已经完成全基因组测序的43株立克次体的所有基因形成一个包含4837个基因的泛基因组和一个包含693个基因的核心基因组。进一步利用泛基因组对43株立克次体进行了系统进化分析,为深入认识立克次体提供了一个新的角度。本研究系统分析了C3H/HeN小鼠感染黑龙江立克次体后不同时相脾脏的mRNA、lncRNA以及miRNA的转录变化,试图全面反映小鼠感染早期脾脏发生的一系列基因转录水平的改变,从而为全面探讨远东斑点热的早期致病过程和致病机理提供依据。通过感染前后不同时相差异转录mRNA分析发现,感染后3小时,il6、mcp-1等细胞因子基因转录上调,趋化因子及其受体转录上调,基因功能富集分析表明巨噬细胞吞噬活性增强,以上现象提示此时炎症反应已经启动。感染后3天,tnfr1转录升高,TPK通路活性增强。TNF-α与TNFR1结合并招募接头蛋白最终活化NF-KB,也可以诱导细胞凋亡,说明感染后3天小鼠可能启动了细胞凋亡机制来清除受立克次体感染的细胞。感染后6天,CD28分子表达升高,部分巨噬细胞和单核细胞被诱导转变为巨细胞,同时β防御素的转录增加,它可以帮助杀灭立克次体。通过分析天然免疫、获得性免疫、炎症反应相关基因的转录差异分别筛选出39个、37个、和41差异转录基因。感染后,天然免疫相关基因ccl2、gbp10、irg1、ill2b和ubd等转录上调,ill2b、isg20、trim10、rsad2、trim59、cr2和snca等转录下调。gbp家族、ccl2、irgl的转录在感染后3天急剧上调之后维持较高的转录水平,这表明感染后细胞对干扰素的应答活跃。由于立克次体的感染能激活NF-KB,NF-KB进而促进ccl2等早期应答基因的转录,并促进炎症反应。cfb转录上调,而fcna转录下调说明补体激活选择了替代途径。推测黑龙江立克次体的LPS强烈刺激CD14+免疫细胞的增殖,引发一系列针对内毒素的免疫反应。感染后3天,il6和il12b的转录升高,说明TLR相关通路启动,引起促炎因子产生并诱导Thl型和Th17型反应。获得性免疫相关基因gzmb在感染后三个时相均上调,说明NK细胞活性增强,分泌GZMB,识别并杀伤立克次体。c4b、clrb等多个补体活化相关基因在感染后3天转录上调,提示补体系统被激活并参与对抗立克次体。Myd88的转录在感染后持续处于3倍左右的升高,TLR通过它能够激活转录因子NF-KB。sema4a、gadd45g、relb、il18bp、relb、bc13等基因在感染后转录升高说明黑龙江立克次体感染后主要激活Thl型免疫反应,而baft基因在感染后转录上调并持续处于3倍以上的水平说明Th17细胞也参与了抗立克次体细胞免疫应答。炎症相关基因转录差异分析发现,感染后很多趋化因子如ccl和cxcl及相应的受体基因的转录上调呈现先升高后降低的趋势,而ccl8则是逐渐升高的。白细胞介素ilia、il1b、il10、il27等基因的转录类似于趋化因子,呈现先升高后降低趋势。其中il27升高最为显著,其作用是促进Th1型反应并抑制Th17型免疫反应。凋亡调控相关蛋白Bcl-2相关的抗凋亡基因3和fas基因转录水平升高说明小鼠为应对立克次体感染启动了促凋亡机制。本研究预测了1915个1ncRNA,分析了1ncRNA的转录。分析发现IncRNA的表达量低于mRNA,但特异性高于mRNA。本研究检测了已知miRNA的转录差异,筛选出4个时相差异转录miRNA,进行了miRNA靶基因的功能富集分析；重点筛选出8个基础转录水平较高并且时相差异转录的miRNA,包括mmu-miR-378c、mmu-miR-222-3p、mmu-miR-210-3p、mmu-miR-146b-5p、mmu-miR-21a-3p、mmu-miR-21a-5p、mmu-miR-122-5p、mmu-miR-378a-5p。另外,我们预测了72个潜在的新miRNA并预测了相应的靶基因,筛选出时相差异转录的新miRNA,进行了新miRNA靶基因的功能富集分析；筛选出8个高表达并且时相差异转录的新miRNA。这些miRNA有可能在C3H/HeN小鼠感染黑龙江立克次体后的免疫调控中起到重要的调控作用。
【作者】段长松；
【导师】温博海；
【作者基本信息】中国人民解放军军事医学科学院，微生物学，2014，博士
【关键词】黑龙江立克次体；基因组测序；RNA测序；miRNA；lncRNA；

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